樊遠志,張峻峰,吳耀持

(上海市第六人民醫(yī)院,上海 200233)

神經(jīng)病理性疼痛作用機制復(fù)雜,當機體檢測到有害刺激的存在時,引起突觸膜去極化,發(fā)生器電位,當器電位足夠大時,會觸發(fā)一個動作電位,該動作電位沿著背根神經(jīng)節(jié)(DRG)傳入神經(jīng)元,神經(jīng)元投射后將疼痛相關(guān)信息傳遞到脊髓背角的中央末端,從而產(chǎn)生疼痛感[1-3]。既往研究證實了針刺足三里和三陰交兩個穴位可有效緩解神經(jīng)病理性疼痛[4]。近年來多項研究發(fā)現(xiàn),在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生過程中,機體炎癥相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白的表達水平會受到激活或抑制,從而參與調(diào)節(jié)機體炎癥反應(yīng),達到激發(fā)或緩解疼痛的目的。因此,找到神經(jīng)病理性疼痛相關(guān)蛋白,對于神經(jīng)病理性疼痛的治療具有一定臨床意義[5-6]。坍塌反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2(Collapsin response mediator protein-2,CRMP2)是一種與受體運輸和離子通道密切相關(guān)的蛋白,主要在腦組織中表達,可與微管蛋白結(jié)合,參與神經(jīng)元的調(diào)節(jié)和線粒體形態(tài)的變化[7]。泛素結(jié)合酶9(Ubiquitin-Conjugating Enzyme 9,Ubc9)是泛素結(jié)合酶E2家族中的一員,Ubc9可與ubi-quitin樣修飾物(SUMO)相結(jié)合,從而激活神經(jīng)細胞內(nèi)CRMP2的表達,起到誘導鎮(zhèn)痛的作用[8]。本研究構(gòu)建了慢性壓迫性損傷(Chronic constriction injury, CCI)大鼠模型,選擇了與神經(jīng)病理性疼痛治療相關(guān)的足三里和三陰交兩個穴位,采用電針和CRMP2激活劑對大鼠進行干預(yù)治療,觀察大鼠疼痛測試情況,探討電針和CRMP2相關(guān)蛋白的表達水平對CCI大鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

12周齡SPF級雄性SD大鼠,購自重慶陸軍軍醫(yī)大學[動物生產(chǎn)許可：SCXK(渝)2022-0013;動物使用許可：SYXK(渝)2022-0007;動物合格證：20206132],體質(zhì)量(180～200)g,所有大鼠飼養(yǎng)于室溫：20～25 ℃,濕度：40%～60%的SPF級動物房內(nèi),動物房內(nèi)采用光照(12 h/12 h)模擬晝夜交替,本實驗所有動物均自由飲水飲食。本研究已通過本院倫理委員會審批通過,并嚴格執(zhí)行《實驗動物管理條例》。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 伯樂BIO-RADXR凝膠成像系統(tǒng)(購自美國伯樂公司,型號BIO-RADXR);Bio-Rad伯樂實時熒光定量PCR儀(購自美國伯樂公司,型號CFX Opus96/CFX Opus384);韓式電針儀(購自南京濟生醫(yī)療科技有限公司,型號：HANS100-A)。

1.2.2 試劑 CRMP2激活劑(南京建成生物工程研究所,純度：99.99%,批號：AD-512);放射免疫沉淀(RIPA)緩沖液、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(購自蘇州宇恒生物科技有限公司,批號DP3012、DK3364);白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-8(IL-8)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(上海優(yōu)寧維生物有限公司,批號：HL-1126、HL-7524和HL-3329); RT-qPCR試劑盒、蛋白定量試劑盒(南京建成生物有限公司,批號：DK5123、FA7829);CRMP2、Ubc9和β-actin蛋白抗體(美國,abcam公司,批號：AB-7213、AB-7306和AB-1122)。

1.3 CCI大鼠模型制備

各組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,采用10 mg/kg甲苯噻嗪和40 mg/kg氯胺酮肌內(nèi)注射麻醉大鼠,固定大鼠后分離右側(cè)臀部坐骨神經(jīng),在坐骨神經(jīng)分叉的近心端輕微地做4個結(jié)扎,然后縫合傷口,術(shù)后7 d檢測大鼠手術(shù)側(cè)和非手術(shù)側(cè)(患健側(cè))縮足潛伏期差值(PWLD),當PWLD>4 s即表示建模成功[9]。

1.4 實驗分組

選取雄性SD大鼠40只,根據(jù)隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分成假手術(shù)組、模型組、電針組與電針+激活劑組,每組10只。電針組每只大鼠每天進行1次電針干預(yù),電針+激活劑組大鼠于每日開始電針治療前1 h腹腔注射CRMP2激活劑(50 ng/kg),其余各組同時間進行抓取大鼠動作,但不做電針和激活劑注射處理,持續(xù)5 d。

1.5 電針干預(yù)

找到大鼠后肢膝關(guān)節(jié),參照《實驗針灸學》[10]大鼠穴位圖譜定位到足三里(外側(cè)腓骨小頭下約5 mm處)和三陰交上外側(cè)5 mm處穴位,用針灸針(江蘇省蘇州市醫(yī)療用品有限公司生產(chǎn)的華佗牌一次性針灸針,規(guī)格為1寸,0.30 mm×25 mm)刺入足三里和三陰交兩個穴位,針的端口連接HANS-200E型韓氏電針儀,同時進行電流強度1 mA,頻率2 Hz/100 Hz的刺激,持續(xù)時間為30 min。30 min取下針灸針,將大鼠放回動物架。

1.6 大鼠痛覺敏感性檢測

大鼠痛覺敏感性的測定：在大鼠造模前、造模后1 d和造模后7 d分別使用足底測痛儀檢測大鼠患健側(cè)縮足潛伏期(Paw withdrawal latency,PWL),采用熱光源對大鼠患側(cè)足底進行照射,記錄大鼠出現(xiàn)躲避、舔舐和抬足等動作的時間,每只大鼠測量3次,取均值。同時比較患側(cè)和健康側(cè)的測定時間,計算患健側(cè)縮足潛伏期差值(PWLD),每只大鼠重復(fù)測定3次,每次測定間隔5 min。

1.7 血清炎癥因子檢測

最后一次電針治療后,當天晚上禁食禁水12 h,第2天采用無水乙醚麻醉大鼠,將大鼠固定于解剖板上,并進行消毒。非抗凝管心臟取血后1 500 r/min,4 ℃條件下離心20 min后取上清,保存于-80 ℃冰箱。室溫下解凍-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆玫拇笫笱?采用ELISA法檢測血清中IL-1β、IL-6和IL-8的水平,根據(jù)ELISA試劑盒說明書對血清樣本進行處理,采用全自動酶標儀在450 nm波長處檢測樣本吸光度,根據(jù)標準品的吸光度結(jié)果得到標準曲線和計算公式,通過公式計算樣品中IL-1β、IL-6和IL-8的濃度。

1.8 大鼠脊髓中CRMP2與Ubc9 mRNA測定

大鼠麻醉處死后,取脊髓腰L2～4組織0.1 g,根據(jù)RNA提取試劑盒提取總RNA,并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA保存至-80 ℃?zhèn)溆?。RT-qPCR體系：SYBR Green qPCR SuperMix 16.25 μL,特異性引物2.0 μL,模板cDNA3.25 μL,加入DEPC水,使反應(yīng)體系為30 μL。擴增條件：94 ℃,12 min;94 ℃,15s;62 ℃,40 s;72 ℃,30 s;共40個循環(huán)。設(shè)置3個復(fù)孔,根據(jù)公式(2-ΔΔCT法)計算、分析mRNA表達。引物序列：CRMP2：5′-CATGTGCTGTAGCTAGTCGAT-3′,5′-AACTGTAGTGCTAGTCGATG-3′; Ubc9：5′-CCGATGTCGTGTGTAGTTCAGTTT-3′,5′-TAATCGTTAGTCGTAGTTAGTCGATC-3′;GAPDH：5′-GTCGTAGTGTGTGTCGTAGTC-3′,5′-GTCGATGGCGGCGCGTAC-3′。

1.9 大鼠脊髓中CRMP2與Ubc9 蛋白測定

大鼠麻醉處死后,取脊髓腰L2～4組織0.1 g,放入玻璃研磨器中,加入1 mL RIPA溶液充分研磨,3 000 r/min離心10 min后取上清液,檢測蛋白濃度,調(diào)節(jié)蛋白濃度使其為3 μg/mL,每孔上樣量為10 μL后進行電泳,將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜,5%脫脂奶粉溶液對硝化纖維素膜封閉2 h后,將特異性抗體CRMP2、Ubc9和β-actin一抗1∶5 000稀釋,4 ℃條件下一抗搖晃孵育12 h,孵育后的硝化纖維素膜使用1%吐溫20清洗3次,每次5 min,清洗后二抗(1∶500)孵育2 h,孵育后清洗步驟同上,最后使用顯影劑后在凝膠成像系統(tǒng)上顯影。

1.10 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 電針干預(yù)對大鼠痛覺敏感性的影響

CCI大鼠模型建成后,各組大鼠PWLD均顯著升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);在給予大鼠相應(yīng)干預(yù)后,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠患健側(cè)PWLD升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組比較,電針組和電針+激活劑組大鼠患健側(cè)PWLD降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);電針+激活劑組干預(yù)5 d后PWLD低于電針組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠患健側(cè)PWLD比較

2.2 電針干預(yù)對大鼠血清炎癥因子的影響

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清IL- 1β、IL-6和IL-8表達水平更高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組比較,電針組和電針+激活劑組大鼠血清IL- 1β、IL-6和IL-8表達水平更低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);電針+激活劑組血清IL- 1β、IL-6和IL-8表達水平低于電針組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清炎癥因子比較

2.3 電針干預(yù)對大鼠脊髓CRMP2、Ubc9 mRNA表達的影響

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠脊髓CRMP2、Ubc9 mRNA表達水平更低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組比較,電針組和電針+激活劑組大鼠脊髓CRMP2、Ubc9 mRNA表達水平更高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);電針+激活劑組大鼠脊髓CRMP2、Ubc9 mRNA表達水平高于電針組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3、圖1。

注：A/B.CRMP2 mRNA檢測溶解曲線/峰值圖;C/D.Ubc9 mRNA檢測溶解曲線/峰值圖。圖1 各組大鼠脊髓CRMP2、Ubc9 mRNA檢測溶解曲線/峰值圖

表3 各組大鼠脊髓CRMP2、Ubc9 mRNA表達水平比較

2.4 電針干預(yù)對大鼠脊髓CRMP2、Ubc9蛋白表達的影響

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠脊髓CRMP2、Ubc9蛋白水平更低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組比較,電針組和電針+激活劑組大鼠脊髓CRMP2、Ubc9蛋白水平更高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);電針+激活劑組大鼠脊髓CRMP2、Ubc9蛋白水平高于電針組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4、圖2。

注：A.假手術(shù)組;B.模型組;C.電針組;D.電針+激活劑組。圖2 各組大鼠脊髓CRMP2、Ubc9蛋白表達情況

表4 各組大鼠脊髓CRMP2、Ubc9蛋白表達水平比較

3 討論

神經(jīng)病理性疼痛是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)性疾病,臨床表現(xiàn)為異常性疼痛、自發(fā)性疼痛和痛覺過敏等,在臨床上神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病率約為3.3%～17.9%[11]。機體發(fā)生神經(jīng)病理性疼痛的因素有很多,其中主要包含物理傷害、自身免疫性疾病和機體感染等,目前臨床上對于神經(jīng)病理性疼痛還沒有有效的根治措施,因此對患者的生活質(zhì)量造成了嚴重的困擾[12]。既往已有大量研究證實了電針刺激在神經(jīng)性疼痛的治療中具有較好的效果,電針可通過刺激足三里和三陰交兩個穴位來抑制CCI小鼠背根神經(jīng)節(jié)外核苷酸酶PAP的降解以緩解神經(jīng)性疼痛[13]。因此,探討電針治療對CCI模型大鼠神經(jīng)性疼痛的緩解作用,對于臨床上該類疾病的治療具有重要意義。本研究對CCI模型大鼠進行電針干預(yù)治療,大鼠痛覺敏感性測定結(jié)果顯示各組間PWLD存在顯著差異,提示電針對于CCI大鼠具有一定的治療作用,可有效降低PWLD時間,降低疼痛引起的損傷,從而具有緩解大鼠神經(jīng)病理性疼痛的功效,提示電針有成為臨床上神經(jīng)性疼痛相關(guān)疾病治療方法的潛質(zhì)。

從免疫性角度而言,神經(jīng)性病理疼痛是一種異常的中樞刺激信號,必然會引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫功能的紊亂,隨著炎癥在各種疾病中的生物學作用越來越受到重視,有研究發(fā)現(xiàn)在絕大多數(shù)疾病發(fā)展過程中均伴隨著炎癥反應(yīng)的進行[14]。免疫系統(tǒng)功能的紊亂常常伴隨著相關(guān)蛋白表達水平的異常改變,如CRMP2和Ubc9蛋白,因此通過檢測相關(guān)蛋白的表達在一定程度上可以反映機體免疫系統(tǒng)受損傷程度。神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生常常伴隨著炎癥反應(yīng)的發(fā)生,神經(jīng)病理性疼痛的病灶中往往存在多種炎癥細胞(如肥大細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞與巨噬細胞等)的浸潤,且其炎性細胞浸潤數(shù)與神經(jīng)病理性疼痛的嚴重程度有關(guān)[15]。大量炎性細胞的浸潤可導致平滑肌肥大,從而加劇結(jié)構(gòu)細胞的破壞,最終導致病灶部位結(jié)構(gòu)改變,進而加劇疾病對機體造成的損傷[16]。炎癥反應(yīng)被認為在眾多疾病的發(fā)病機制中有著至關(guān)重要的作用,疾病發(fā)生后可引起機體炎癥因子水平的急劇上升[17]。既往研究發(fā)現(xiàn)CRMP2、Ubc9蛋白與機體免疫系統(tǒng)平衡密切相關(guān),當機體免疫系統(tǒng)發(fā)生紊亂時,可導致CRMP2和Ubc9蛋白的表達異常,從而引起免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)失衡[18]。有研究發(fā)現(xiàn),當神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生時,炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-6和IL-8均急劇上升,且隨著炎癥水平的加重而增加,而高表達的炎性因子將進一步加劇疼痛的發(fā)生,因此抑制炎癥反應(yīng)成為了神經(jīng)病理性疼痛治療的有效方式之一[19]。CRMP2和Ubc9作為炎癥抑制蛋白,可抑制細胞促炎因子的表達,從而達到緩解機體炎癥的目的[20]。因此,本研究檢測了大鼠IL-1β、IL-6和IL-8水平,以反映機體炎癥反應(yīng)程度。研究結(jié)果顯示,當大鼠CCI發(fā)生時,其血清內(nèi)IL-1β、IL-6和IL-8水平均顯著升高,表明炎癥反應(yīng)發(fā)生。當采用電針治療后,IL-1β、IL-6和IL-8水平顯著降低,且大鼠疼痛得以緩解,提示電針刺激可能會抑制炎癥反應(yīng),從而達到鎮(zhèn)痛的效果,其機制可能是疼痛引起了CRMP2和Ubc9的表達抑制,從而免疫系統(tǒng)紊亂導致炎癥因子分泌增加,機體炎癥反應(yīng)發(fā)生,而電針刺激后激活機體免疫防護機制,激活相關(guān)蛋白基因CRMP2和Ubc9的轉(zhuǎn)錄及翻譯水平,而高表達的CRMP2和Ubc9可有效抑制機體炎癥反應(yīng)的發(fā)生,緩解疼痛反應(yīng)。因此,電針治療可能是通過激活CRMP2和Ubc9來起到降低炎癥反應(yīng)及緩解疼痛的作用,從而達到治療神經(jīng)性疼痛的效果,提示CRMP2和Ubc9可能是電針治療的有效靶分子。

CRMP2和Ubc9的主要表達部位為大腦神經(jīng)細胞內(nèi),大量研究結(jié)果顯示CRMP2和Ubc9的表達水平與大腦的神經(jīng)系統(tǒng)損傷密切相關(guān)[21]。既往研究發(fā)現(xiàn),在神經(jīng)病理性疾病中,Ubc9被激活,與下游信號因子結(jié)合后形成泛素化結(jié)合酶聚體,泛素化結(jié)合酶聚體可促進CRMP2的表達,抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,從而達到鎮(zhèn)痛的功效[22]。有研究發(fā)現(xiàn)CRMP2和Ubc9的異常改變可引起機體免疫平衡紊亂,從而影響炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展[23]。既往研究顯示,激活CRMP2可調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞突觸間的信號分子,從而影響突觸信號傳導,對疼痛的傳導起到一定的緩解作用[24]。CRMP2的高表達同時可抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生,體內(nèi)動物實驗結(jié)果顯示,對嚴重感染的大鼠使用CRMP2激活劑,發(fā)現(xiàn)較普通大鼠感染癥狀顯著減輕,同時檢測血清炎癥因子指標發(fā)現(xiàn)較模型大鼠明顯下降,因此推測CRMP2具有炎癥抑制作用[25]。本研究在電針刺激的同時,對一組大鼠腹腔注射了CRMP2激活劑以提高CRMP2的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)電針可有效提高脊髓中CRMP2的表達,從而達到鎮(zhèn)痛的效果,而電針聯(lián)合CRMP2激活劑可進一步提高CRMP2的表達,且結(jié)合大鼠痛覺敏感性和血清炎癥因子檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),CRMP2的高表達與鎮(zhèn)痛效果密切相關(guān),且高表達的CRMP2炎癥反應(yīng)抑制效果更明顯,進一步提示了CRMP2可能通過抑制炎癥反應(yīng)以達到鎮(zhèn)痛的效果,同時也進一步表明電針治療的分子機制可能是通過激活CRMP2的表達,抑制炎癥反應(yīng),以達到緩解神經(jīng)性疼痛的作用。因此,電針治療可能會成為臨床神經(jīng)性疼痛治療的新方向。

綜上所述,電針可有效緩解CCI模型大鼠神經(jīng)病理性疼痛,其作用機制可能是電針刺激穴位后促進神經(jīng)細胞內(nèi)CRMP2、Ubc9表達水平,從而抑制CCI發(fā)生后產(chǎn)生的機體炎癥反應(yīng),以達到鎮(zhèn)痛和治療的效果。