張冬雪 曲帥 王明月 蘇麗麗 徐晨 闞鴻* 董凱*

1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130118 2.吉林省生物研究所藥用真菌研究室,吉林 長(zhǎng)春 130012

骨質(zhì)疏松癥是一種代謝性骨骼疾病,其特征是骨密度降低和微觀結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致骨折風(fēng)險(xiǎn)增加[1]。常見的骨質(zhì)疏松癥類型包括原發(fā)性、繼發(fā)性和老年性[2]。原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥又稱絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥,可能由雌激素缺乏引起破骨細(xì)胞活性增強(qiáng),同時(shí)骨形成與骨吸收之間不平衡導(dǎo)致骨質(zhì)流失[3]。激素療法一直用于預(yù)防和治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥[4]。然而,長(zhǎng)期服用激素會(huì)增加心血管疾病和靜脈血栓栓塞的風(fēng)險(xiǎn)[5]。因此,從天然植物中挖掘安全高效的功能性組分改善骨質(zhì)疏松已成為當(dāng)前重要的研究方向。

骨營養(yǎng)劑氨基葡萄糖和硫酸軟骨素具有軟骨保護(hù)作用,可以預(yù)防和改善關(guān)節(jié)損傷,但兩者聯(lián)用治療骨質(zhì)疏松時(shí),存在起效較慢、用藥劑量大、服用周期長(zhǎng)等問題[6]。淫羊藿總黃酮能夠刺激成骨細(xì)胞骨形成和減少破骨細(xì)胞骨吸收,激活骨重建,是預(yù)防或治療與雌激素缺乏相關(guān)的骨質(zhì)疏松癥的有效藥物[7-9],氨基葡萄糖-硫酸軟骨素組合與淫羊藿總黃酮在治療骨質(zhì)疏松方面是否存在協(xié)同增效作用,尚未見報(bào)道。

研究發(fā)現(xiàn),骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展受多種通路影響,其中PI3K/AKT信號(hào)通路是參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、分化、凋亡及調(diào)控骨代謝過程的關(guān)鍵通路[10-11]。Toll樣受體4(TLR4)是PI3K/AKT信號(hào)通路的上游因子,能夠介導(dǎo)骨髓細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子作用于骨代謝[12]。本研究通過建立骨質(zhì)疏松大鼠模型探討骨營養(yǎng)劑氨基葡萄糖-硫酸軟骨素與淫羊藿總黃酮是否可以通過激活TLR4/PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)揮協(xié)同治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

40只雌性SD大鼠,質(zhì)量180～220 g,購自長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(吉)-2020-0001,符合吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定;淫羊藿原藥材購于長(zhǎng)白山淫羊藿種植基地;氨基葡萄糖(M-AT-1904020),浙江金殼藥業(yè)有限公司;硫酸軟骨素(HS1904270),嘉興恒杰生物制藥有限公司;注射用青霉素鈉(F9027101),華北制藥股份有限公司;戊酸雌二醇片(469A);三溴乙醇(LAT20220815),北京萊艾特科技發(fā)展有限公司;血清Ca測(cè)試盒(N802280G)、血清P測(cè)試盒(N802280P),上海酶聯(lián)生物科技有限公司;堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG)、骨鈣素(osteocalcin,BGP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素10(IL-10)檢測(cè)試劑盒(11/2022),上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1淫羊藿總黃酮提取物的制備:參照文獻(xiàn)[13]中的提取工藝,取淫羊藿葉50 g,加入15倍量的60%乙醇,預(yù)浸30 min,70℃回流提取2次,合并濾液,使用大孔樹脂D100對(duì)提取液進(jìn)行純化,調(diào)整上樣液濃度為1 mg/mL,6倍柱體積(BV)水除去糖類,5 BV 25%乙醇除去非黃酮類雜質(zhì),4 BV 60%乙醇洗脫黃酮類化合物,流速為3 BV/h。洗脫液凍干后得淫羊藿總黃酮提取物干粉,經(jīng)紫外分光光度法在270 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值,測(cè)得淫羊藿總黃酮含量為80%。

1.2.2造模、給藥及處理:實(shí)驗(yàn)大鼠Sham組僅切除腹腔少量脂肪,其余各組大鼠切除雙側(cè)卵巢。術(shù)后腹腔注射青霉素預(yù)防感染。藥物溶解在0.5%羧甲基纖維素鈉中配成混懸液。Sham組和OVX組灌胃生理鹽水;T組給藥500 mg/kg[14],EV組給藥0.1 mg/kg[15],TG組給藥硫酸軟骨素125 mg/kg,氨基葡萄糖150 mg/kg,淫羊藿總黃酮250 mg/kg(給藥量按人體推薦劑量的10倍折算);灌胃體積10 mL/(kg·d)。每周稱量體重并按體重調(diào)整灌胃量,連續(xù)給藥8周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,麻醉后頸脫位對(duì)所有大鼠進(jìn)行安樂死,收集股骨和血液樣本。

1.2.3血清生化指標(biāo):采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清ALP、TRAP、OPG、BGP、TNF-α和IL-10水平,微量法測(cè)定血清Ca和血清P濃度。

1.2.4骨密度測(cè)定:采用Micro-CT儀器對(duì)大鼠左側(cè)股骨進(jìn)行掃描,并定量分析骨小梁指標(biāo)參數(shù)。主要測(cè)量參數(shù)指標(biāo)包括骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)(Tb.N)、骨表面積密度(BV/TV)和骨質(zhì)疏松指數(shù)(SMI)。

1.2.5骨生物力學(xué)測(cè)定:采用萬能材料力學(xué)試驗(yàn)機(jī)檢測(cè)左脛骨,記錄受試骨組織斷裂前的最大彎曲力及最大彎曲變形,計(jì)算彎曲剛度,彈性模量及彎曲應(yīng)力參數(shù)。

1.2.6骨組織病理學(xué)檢查:對(duì)大鼠右股骨進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(HE)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,觀察股骨的病理學(xué)變化和破骨細(xì)胞生成情況。

1.2.7免疫組織化學(xué)分析:取右股骨進(jìn)行TLR4、PI3K及AKT免疫組化染色觀察。圖像結(jié)果采集后使用Image-J軟件對(duì)陽性染色的細(xì)胞進(jìn)行定量,用光密度(AOD)表示。

1.2.8實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)檢測(cè)蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)水平:取100 mg股骨組織,首先使用Trizol法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄獲得c DNA,并以c DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(共20 μL):SYBR熒光染料10μL,上、下游引物各2μL,c DNA模板4μL,無核酸酶水2μL。反應(yīng)條件:93℃預(yù)變性5 min,95℃變性2 min,75℃退火40 s,60℃延伸60 s,循環(huán)45次,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參,采用2-△△Ct法計(jì)算各目標(biāo)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用 Graphpad prism 8.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,通過單因素方差分析評(píng)估各組間的平均差異,P<0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重和子宮濕重分析

卵巢摘除能夠?qū)е麦w內(nèi)的雌激素水平下降。與Sham組相比,手術(shù)摘除卵巢的各組大鼠血清中雌二醇水平明顯降低(P<0.05),見圖1A。與Sham組相比,所有處理組的大鼠體重均明顯升高,這是因?yàn)槁殉舱龑?dǎo)致大鼠腹部形成脂肪堆積,引起體重增長(zhǎng),而EV組、T組和TG組大鼠體重均小于OVX組,見圖1B。此外,與 Sham 組相比,各實(shí)驗(yàn)組大鼠子宮明顯變小,重量減輕4倍以上(P<0.05);與OVX組相比,給藥后大鼠子宮有所改善,子宮濕重明顯增加(P<0.05);與T組相比,TG組子宮濕重增加顯著(P<0.05),見圖1C。

圖1 各組大鼠血清雌二醇(A)、體重(B)、子宮濕重(C)變化Fig.1 Changes of serum estradiol (A), Weight changes (B), Changes of wet weight of the uterus (C) in rats in each group注:與Sham組相比,***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05;與OVX組相比,##P<0.01,#P<0.05;與T組相比,▲P<0.05。

2.2 血清生化指標(biāo)

2.2.1大鼠血清礦物質(zhì)水平比較:由圖2可知,與Sham組相比,OVX組血清P濃度顯著升高(P<0.001),血清Ca濃度顯著降低(P<0.001);與OVX組相比,EV組、T組和TG組血清P濃度明顯降低(P<0.05),Ca濃度明顯升高(P<0.05);與T組相比,TG組血清Ca和P濃度呈顯著性變化(P<0.05)。

圖2 各組大鼠血清礦物質(zhì)P (A)、Ca(B)水平變化(n=7)Fig.2 Changes of serum mineral P (A) and Ca (B) levels in rats of each group (n=7)注:與Sham組相比,***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05;與OVX組相比,##P<0.01,#P<0.05;與T組相比,▲P<0.05。

2.2.2大鼠骨代謝指標(biāo)水平比較:由圖3可知,與Sham 組相比,OVX 組大鼠血清中BGP和OPG含量顯著下降(P<0.01),ALP和TRAP含量顯著升高(P<0.01)。經(jīng)過8周藥物治療可以緩解各項(xiàng)指標(biāo)因骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的異常變化,與OVX 組相比,EV組、T組和TG組血清中OPG和BGP含量均有明顯升高(P<0.05),血清ALP和TRAP含量顯著降低(P<0.05)。與T組相比,TG組血清BGP含量明顯升高(P<0.05)。OPG呈上升趨勢(shì),但差異不顯著(P>0.05),ALP和TRAP含量均明顯降低(P<0.05)。

圖3 各組大鼠骨代謝指標(biāo)BGP(A)、OPG(B)、ALP(C)、TRAP(D)變化(n=7)Fig.3 Changes of bone metabolism indexes BGP (A), OPG (B), ALP (C), and TRAP (D) in rats in each group (n=7)注:與Sham組相比,**P<0.01,*P<0.05;與OVX組相比,#P<0.05;與T組相比,▲P<0.05。

2.2.3大鼠炎癥因子水平比較:由圖4可知,與 Sham 組相比,OVX組IL-10的含量明顯下降(P<0.05),而TNF-α的含量升高2倍以上(P<0.001)。與 OVX 組相比,各給藥組血清IL-10含量明顯升高(P<0.05),TNF-α含量明顯降低(P<0.05)。與T組相比,TG組對(duì)炎癥的改善效果更顯著(P<0.05)。

圖4 各組大鼠血清炎癥因子IL-10(A)、TNF-α(B)水平變化(n=7)Fig.4 Changes of serum inflammatory factors IL-10(A) and TNF-α(B) in rats of each group (n=7)注:與Sham組相比,***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05;與OVX組相比,##P<0.01,#P<0.05;與T組相比,▲P<0.05。

2.3 骨密度分析

如圖5所示,切除卵巢后,大鼠小梁骨的微結(jié)構(gòu)顯著惡化,骨量有明顯減少,經(jīng)藥物治療后骨量及骨小梁密度有所增加,其中TG組的效果最顯著。骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)顯示(圖6),與Sham組相比,OVX組的Tb.N、BV/TV和Tb.Th均明顯降低(P<0.05),SMI和Tb.Sp明顯升高(P<0.05)。與OVX組相比,各給藥組中Tb.N、BV/TV、Tb.Th均明顯升高(P<0.05),SMI和Tb.Sp均明顯降低(P<0.05)。

圖5 各組大鼠股骨干骺端骨小梁微結(jié)構(gòu)CT圖(n=7)注:A:Sham組;B:OVX組;C:EV組;D:T組;E:TG組。Fig.5 CT images of trabecular microstructure in the metaphyseal bone of rats in each group (n=7)A: Sham group; B: OVX group; C: EV group; D: T group; E: TG group.

圖6 各組大鼠骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)變化(n=7)Fig.6 Changes in bone microstructural parameters in various groups of rats (n=7)注:與Sham組相比,**P<0.01,*P<0.05;與OVX組相比,##P<0.01,#P<0.05。

2.4 骨生物力學(xué)指標(biāo)分析

如圖7所示,OVX組、EV組、T組和TG組脛骨極限負(fù)荷、剛度和彈性模量參數(shù)較Sham組顯著降低(P<0.05)。與OVX組相比,藥物處理組骨力學(xué)參數(shù)水平明顯升高(P<0.05)。與T組相比,TG組生物力學(xué)指標(biāo)改善更顯著(P<0.05)。

圖7 各組大鼠生物力學(xué)指標(biāo)最大荷載(A)、剛度(B)、彈性模量(C)水平比較(n=7)Fig.7 Comparison of biomechanical indexes of rats in each group: maximum load (A), stiffness (B) and elastic modulus (C) (n=7)注:與Sham組相比,***P<0.01,**P<0.01,*P<0.05;與OVX組相比,##P<0.01,#P<0.05;與T組相比,▲P<0.05。

2.5 骨組織病理學(xué)評(píng)價(jià)

2.5.1HE染色:如圖8所示,Sham組大鼠骨小梁致密,連續(xù)性好,排列整齊;OVX組大鼠骨小梁稀疏,結(jié)構(gòu)紊亂,骨髓孔洞增大,有較多空隙;與OVX組相比,EV組、T組、TG組的股骨骨小梁變粗變密,連接有所增加,骨組織形態(tài)呈現(xiàn)好轉(zhuǎn)。

圖8 各組大鼠骨組織形態(tài)學(xué)觀察(HE染色×100,n=3)Fig.8 Morphological observation of bone tissue of rats in each group (HE staining×100, n=3)

2.5.2TRAP染色:與Sham組相比,OVX組、EV組、T組和TG組破骨細(xì)胞(箭頭)數(shù)量顯著升高(P<0.05);與OVX組比,給藥組均可不同程度抑制陽性破骨細(xì)胞的形成(P<0.05);與T組相比,TG組破骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.05)(圖9)。

圖9 各組TRAP染色,箭頭表示TRAP陽性多核細(xì)胞的區(qū)域(A),TRAP陽性細(xì)胞的定量 (B)(TRAP染色×400,n=3)Fig.9 TRAP staining in each group. The black arrow shows the region of TRAP-positive multinucleated cells (A). Quantification of TRAP-positive cells (B) (TRAP staining×400, n=3)注:與Sham組相比,***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05;與OVX組相比,##P<0.01,#P<0.05;與T組相比,▲P<0.05。

2.6 免疫組化分析

如圖10所示,與Sham組相比,OVX組TLR4陽性表達(dá)顯著升高(P<0.01),PI3K和AKT陽性表達(dá)顯著降低(P<0.01)。與OVX組相比較,EV組和TG組TLR4陽性表達(dá)明顯降低(P<0.05),PI3K和AKT陽性表達(dá)明顯升高(P<0.05),而T組中各基因表達(dá)不顯著(P>0.05)。

2.7 qRT-PCR 檢測(cè)股骨中TLR4/PI3K/AKT信號(hào)通路mRNA的表達(dá)

與Sham組比較,OVX組的PI3K、AKT mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P<0.05),TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.01);與OVX組比較,各給藥組的PI3K、AKT mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(P<0.05),TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05);與T組比較,TG組TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05),PI3K mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05),AKT mRNA表達(dá)水平也有所升高但不顯著(圖11)。

圖11 相關(guān)基因TLR4(A)、PI3K(B)、AKT(C) mRNA表達(dá)(n=3)Fig.11 mRNA expressions of related genes TLR4 (A), PI3K (B), AKT (C) (n=3)注:與Sham組相比,***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05;與OVX組相比,###P<0.001,##P<0.01,#P<0.05;與T組相比,▲P<0.05。

3 討論

絕經(jīng)后雌激素水平低,會(huì)致使骨量下降和骨組織結(jié)構(gòu)退化[16]。在骨代謝指標(biāo)中,骨形成標(biāo)志物BGP和OPG均參與骨吸收的調(diào)節(jié);ALP與骨基質(zhì)礦化相關(guān),抑制ALP活性有利于骨形成;TRAP由成熟的破骨細(xì)胞在骨吸收過程中分泌,反映骨吸收速率;骨基質(zhì)中鈣磷代謝也參與調(diào)控骨質(zhì)疏松,血清Ca和血清P濃度呈負(fù)相關(guān),當(dāng)?shù)土赘哜}穩(wěn)態(tài)被打破時(shí),會(huì)導(dǎo)致骨重建紊亂[17]。相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn),TNF-α可作用于骨代謝,誘發(fā)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的分化、成熟,IL-10則具有抑制破骨細(xì)胞的重聚和活化,激活免疫調(diào)節(jié)作用,可以改善大鼠關(guān)節(jié)炎癥,防治骨破壞[18-19]。大量研究表明,PI3K/AKT信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)骨形成,進(jìn)而控制骨密度平衡[20-21]。TLR4是一種先天免疫應(yīng)答的模式識(shí)別受體,可以干擾骨細(xì)胞的正常功能,是加重骨質(zhì)疏松癥的上調(diào)因素[22]。雌激素缺失會(huì)激活上游TLR4信號(hào)通路,造成免疫級(jí)聯(lián)效應(yīng),過度的激活可誘發(fā)破骨細(xì)胞大量增殖,而下游PI3K/AKT信號(hào)通路的活化可改善骨丟失,TLR4與PI3K/AKT通路呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)[23-24]。

硫酸軟骨素是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分,具有改善軟骨基質(zhì)的合成與分解平衡作用[25]。氨基葡萄糖可刺激糖胺聚糖合成,具有增加成骨細(xì)胞的活性和促進(jìn)新骨形成的作用[26]。二者被廣泛用于恢復(fù)軟骨功能,縮小關(guān)節(jié)間隙和緩解癥狀[27]。淫羊藿總黃酮能夠顯著降低骨小梁的分離度、增加骨密度和改善骨微結(jié)構(gòu)[28-29]。本研究結(jié)果顯示,OVX組大鼠骨密度低于Sham組,表明大鼠去卵巢后雌激素缺乏進(jìn)而導(dǎo)致骨量丟失,而給藥處理后大鼠骨密度增加。與Sham組相比,OVX組大鼠血清P、ALP、TRAP和TNF-α水平明顯升高,血清Ca、BGP、OPG和IL-10水平明顯降低,表明去勢(shì)大鼠會(huì)增加破骨細(xì)胞活性,影響成骨細(xì)胞生成,而給藥治療后骨形成與骨吸收之間的平衡得到改善,聯(lián)合給藥效果更佳。此外,淫羊藿總黃酮聯(lián)用骨營養(yǎng)劑可以減弱TLR4 mRNA的表達(dá),并減弱相應(yīng)基因的表達(dá),增強(qiáng)PI3K和AKT mRNA的表達(dá),進(jìn)而改善骨代謝。

綜上,淫羊藿總黃酮與骨營養(yǎng)劑氨基葡萄糖-硫酸軟骨素聯(lián)合使用可以提高去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨密度,改善骨代謝,并通過激活TLR4/PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)揮協(xié)同治療骨質(zhì)疏松的作用。