馬瑋瑋 陳虹谷 李彤彤 熊勇 李瑛*

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué),湖北 武漢 430061 2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種以骨量減少、骨小梁緩慢流失和骨密度損失為特征的全身性代謝骨疾病[1]。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示,目前全球有超過2億人受到OP的困擾,中國50歲以上人群中OP患病率高達(dá)19.20%[2],預(yù)計(jì)隨著全球人口老齡化的加重,未來這一數(shù)字將繼續(xù)擴(kuò)大[3]。腸道菌群(gut microbiota,GM)作為人體內(nèi)重要的微生態(tài)系統(tǒng),與人體健康息息相關(guān)。隨著腸道菌群在骨代謝領(lǐng)域研究的深入,有學(xué)者提出“腸-骨”軸理論[4-5],指出腸道菌群在人體骨代謝過程中發(fā)揮重要作用。近年來的研究表明腸道菌群通過調(diào)節(jié)激素和免疫功能影響人體營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與代謝,從而對(duì)人體骨代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)[6-7]?；谀c道菌群相關(guān)研究,飲食干預(yù)、益生菌補(bǔ)充和微生物群移植被用于OP的治療[8-9]。但上述研究多是臨床觀察性研究的結(jié)果,可能受到各種偏倚和混雜因素的影響以及反向因果的干擾。

孟德爾隨機(jī)化(mendelian randomization analysis,MR)是利用遺傳變異作為工具變量來識(shí)別危險(xiǎn)因素與疾病之間因果關(guān)系的有效方法[10-11]。孟德爾的獨(dú)立分配法則表明遺傳變異是彼此獨(dú)立的,它們通常不受其他因素或混雜變量的影響。因此,MR研究中的關(guān)聯(lián)性比隨機(jī)化臨床試驗(yàn)(randomized clinical trial,RCT)結(jié)果更可靠[12]。本研究利用來自全基因組關(guān)聯(lián)研究數(shù)據(jù)(genome-wide association studies,GWAS)的公共數(shù)據(jù)進(jìn)行雙樣本MR分析以探討GM與骨密度(bone mineral density,BMD)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究設(shè)計(jì)

本研究選擇GM作為暴露因素,選擇與GM相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNPs)作為工具變量(instrumental variables,IVs)。骨密度在臨床實(shí)踐中被廣泛用作骨質(zhì)流失的可測(cè)量和強(qiáng)預(yù)測(cè)指標(biāo),被用作結(jié)果變量。使用雙樣本MR分析的方法對(duì)GM與BMD進(jìn)行孟德爾隨機(jī)化分析,并利用Cochran’s Q與MR Egger法檢驗(yàn)評(píng)估異質(zhì)性與水平多效性,最后進(jìn)行敏感度分析來驗(yàn)證結(jié)果的穩(wěn)定性。

MR分析需要滿足3個(gè)條件假設(shè)[13]:①IVs與暴露因素之間存在很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性;②IVs在暴露和結(jié)果的關(guān)聯(lián)性上不存在混合因素,即不存在遺傳多態(tài)性;③IVs對(duì)結(jié)果沒有直接影響,只能通過暴露因素影響結(jié)果。見圖1。

圖1 兩樣本孟德爾隨機(jī)化模型示意圖Fig.1 Schematic diagram of two sample Mendelian randomization models

1.2 數(shù)據(jù)來源

本研究通過英國布里斯托爾大學(xué)(University of Bristol) 的IEU GWAS數(shù)據(jù)庫 (https://gwas.mrcieu.ac.uk/terms/)分別獲取GM和BMD的GWAS。其中GM數(shù)據(jù)來自于MiBioGen聯(lián)合會(huì)的一項(xiàng)研究,分析了18 340名參與者的宿主基因型和16S糞便菌群rRNA基因測(cè)序剖面[14]。在這項(xiàng)GWAS研究中檢查了211個(gè)GM分類群(從屬到門級(jí)別),最終確定了與9個(gè)門、16個(gè)綱、20個(gè)目、35個(gè)科和131個(gè)屬相關(guān)聯(lián)的腸道菌群遺傳變異[14]。本研究使用的BMD數(shù)據(jù)來自于一項(xiàng)大規(guī)模GWAS薈萃分析的總體水平數(shù)據(jù),該分析中包括30個(gè)項(xiàng)目研究和66 628名參與者(其中56 284名參與者為歐洲血統(tǒng)),其中全身骨密度(total body BMD,TB-BMD)通過DXA進(jìn)行測(cè)量(以g/cm2為單位)[15]。TB-BMD的SNPs已經(jīng)通過線性回歸模型進(jìn)行協(xié)變量校正(年齡、體重、身高等)[15]。

1.3 工具變量選擇

為了滿足第一個(gè)關(guān)鍵假設(shè),即相關(guān)性假設(shè),IVs應(yīng)該與暴露因素具有顯著相關(guān)[16]。本研究通過GWAS數(shù)據(jù)集在全基因組水平(P<1×10-8)上確定與GM相關(guān)的SNPs[17]。隨后,通過連鎖不平衡(linkage disequilibrium,LD)聚類獲得暴露的獨(dú)立SNPs,聚類閾值為R2<0.1,等位基因距離大于500 kb[18]。然后從GWAS數(shù)據(jù)集中提取與BMD相關(guān)的SNPs及其相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),同時(shí)排除MAF低于0.01的SNPs[19]。僅考慮分析中具有關(guān)聯(lián)估計(jì)的遺傳變體,未使用代理變量。此外,通過刪除所有回文SNP,數(shù)據(jù)得到協(xié)調(diào)[20]。為了滿足第二個(gè)MR假設(shè),即獨(dú)立性假設(shè),筆者使用PhenoScannerV2數(shù)據(jù)庫(http://www.phenoscanner.medschl.cam.ac.uk/)研究每個(gè)IV及其代理特征,并在R2>0.80的閾值上去除和混雜因素相關(guān)的SNPs[21]。

1.4 孟德爾隨機(jī)化分析

本研究中主要采用逆方差加權(quán)法(inverse variance weighted,IVW)、MR-Egger回歸和加權(quán)中位數(shù)法(weighted median estimator,WME)進(jìn)行MR分析。在滿足所有SNP都是有效的工具變量的假設(shè)下,IVW方法能提供最為準(zhǔn)確的效應(yīng)估計(jì)值[22]。MR-Egger回歸可以檢測(cè)和調(diào)整多效性,但這種方法產(chǎn)生的估計(jì)精度非常低[23]。加權(quán)中位數(shù)基于至少50%的IVs是有效的假設(shè),給出準(zhǔn)確的估計(jì)結(jié)果[24]。由于IVW法比其他兩種方法檢驗(yàn)效能更高,因此本研究采取IVW法作為主效分析[24]。

1.5 敏感性分析

留一法通過逐個(gè)剔除某個(gè)工具變量來探討是否存在單個(gè)SNPs驅(qū)動(dòng)因果關(guān)聯(lián),如果剔除單個(gè)SNPs后對(duì)MR分析影響較大,則表明MR分析受單個(gè)工具變量的干擾。其次,MR-Egger截距用于評(píng)估IVs與其他潛在混雜因素間的多效性關(guān)系,確保選擇的IVs不會(huì)通過除暴露因素以外的途徑影響結(jié)局變量。若MR-Egger截距分析表明存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),則表明存在水平多效性[25]。最后,本研究還使用Cochran’s Q 統(tǒng)計(jì)量來進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)。若Cochran’s Q 統(tǒng)計(jì)量檢驗(yàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),則證明分析結(jié)果具有顯著的異質(zhì)性[26]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究使用RStudio軟件中的TwoSampleMR包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,結(jié)果用β值以及相應(yīng)的95%置信區(qū)間(confidence interval,CI)來解釋GM對(duì)BMD的影響,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 孟德爾隨機(jī)化結(jié)果

首先,確定與腸道菌群在門、綱、目、科和屬水平上相關(guān)的SNPs,經(jīng)過一系列的質(zhì)控步驟,選出的IVs進(jìn)行孟德爾隨機(jī)化研究,IVW結(jié)果表明巴氏桿菌屬(OR=1.07,95%CI:1.02～1.13,P=0.01)、乳鏈球菌屬(OR=1.04,95%CI:1～1.08,P=0.01)、瘤胃球菌科UCG002(OR=1.06,95%CI:1～1.13,P=0.03)和瘤胃球菌科UCG005(OR=1.06,95%CI:1～1.12,P=0.03)可能是骨密度的保護(hù)性因素。但戈登氏桿菌屬(OR=0.96,95%CI:0.93～0.99,P=0.01)、草酸梭菌屬(OR=0.96,95%CI:0.92～0.99,P=0.01)和泰瑟氏菌屬(OR=0.95,95%CI:0.92～0.99,P=0.02)可能為骨密度潛在危險(xiǎn)性因素,同時(shí)可能存在未知腸道菌群對(duì)骨密度造成潛在威脅(OR=0.94,95%CI:0.92～1.00,P=0.002),見圖2。同時(shí)也運(yùn)用MR-Egger回歸和加權(quán)中位數(shù)法對(duì)腸道菌群與骨密度之間的關(guān)系進(jìn)行分析,見表1。

表1 與BMD具有顯著相關(guān)性的腸道菌群MR效應(yīng)值Table 1 MR effect values of gut microbiota with significant correlation with BMD

圖2 與BMD具有因果聯(lián)系的腸道菌群效應(yīng)值森林圖Fig.2 Forest map of gut microbiota effect values with causal relationship with BMD

2.2 敏感性分析

Cochran’s Q和MR-Egger回歸法結(jié)果表明本研究不存在顯著的異質(zhì)性和多效性(表2)。留一法結(jié)果顯示在逐一剔除SNP后,結(jié)果并沒有發(fā)生改變。這些分析在一定程度上證明了本研究結(jié)果的穩(wěn)健性。

表2 敏感性分析結(jié)果Table 2 Sensitivity analysis results

3 討論

本研究旨在探討腸道菌群是否與骨密度之間存在因果聯(lián)系,通過孟德爾隨機(jī)化全面評(píng)估了211種腸道菌群(從門到屬的級(jí)別)對(duì)骨密度的因果效應(yīng),結(jié)果顯示某些腸道菌群與骨密度之間存在因果聯(lián)系,這些結(jié)果表明腸道菌群可能是骨密度的重要影響因素,同時(shí)也意味著腸道菌群在骨質(zhì)疏松癥發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用。

大量的臨床觀察性研究表明GM同BMD之間存在聯(lián)系,這與本研究結(jié)果是一致的[27-31]。在人體中腸道菌群主要為厚壁菌門和擬桿菌門,占腸道菌群相對(duì)豐度的90%以上,其次是放線菌門、變形菌門、聯(lián)合菌門、梭菌門等[32]。骨骼是一個(gè)不斷進(jìn)行骨形成和骨吸收的動(dòng)態(tài)器官,這兩個(gè)過程是骨代謝的主要活動(dòng)。骨細(xì)胞在體內(nèi)進(jìn)行新陳代謝,參與各種骨骼組織的生理和病理過程。在細(xì)胞層面,骨細(xì)胞之間的相互作用對(duì)于骨骼的形態(tài)起著關(guān)鍵作用。破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞是骨代謝的關(guān)鍵組成部分,而骨代謝失衡可引發(fā)骨質(zhì)疏松癥。因此,骨穩(wěn)態(tài)需要保持骨代謝的平衡。平衡的骨代謝對(duì)于維持鈣、磷等礦物質(zhì)的代謝平衡以及骨密度和骨強(qiáng)度具有重要的積極作用。隨著對(duì)腸道菌群研究的不斷深入,其與骨代謝的關(guān)系也得到了更多關(guān)注。

目前研究還沒有完全確定GM與BMD之間的作用機(jī)制,但以往的一些研究探討了GM和BMD之間可能存在的幾種機(jī)制:①腸道菌群可以影響雌激素代謝調(diào)控骨代謝。正常情況下,雌激素作為腸肝循環(huán)產(chǎn)物需要經(jīng)腸道菌群作用后才能重新進(jìn)入內(nèi)循環(huán)。當(dāng)腸道菌群失衡時(shí),腸肝循環(huán)減弱,機(jī)體內(nèi)雌激素重吸收能力下降,加速體內(nèi)骨質(zhì)的流失與骨質(zhì)疏松癥的病程[33-34]。②腸道菌群通過炎癥因子影響骨代謝。炎癥反應(yīng)引起局部的免疫細(xì)胞浸潤(rùn),釋放多種炎癥因子,包括腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和白細(xì)胞介素-17(interleukin-17,IL-17)等,這些炎癥因子可通過多種機(jī)制影響骨細(xì)胞的代謝和功能[35-36]。當(dāng)人體內(nèi)腸道菌群失衡后可刺激腸道內(nèi)的炎癥反應(yīng),導(dǎo)致IL-6和TNF-α等炎性因子大量釋放,在促進(jìn)破骨細(xì)胞活性的同時(shí)也抑制成骨細(xì)胞的形成和功能,最終加劇骨代謝的失衡。③腸道菌群可以通過改善腸道健康來促進(jìn)鈣的吸收和利用。維生素D是維持骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要物質(zhì)之一[37],當(dāng)體內(nèi)鈣攝入不足時(shí),腸道菌群中的細(xì)菌可以產(chǎn)生活性維生素D,從而促進(jìn)腸道對(duì)鈣的吸收[38]。腸道菌群對(duì)于腸道黏膜的健康和完整性至關(guān)重要,它們可以幫助維持腸道屏障的完整性,預(yù)防腸道炎癥和滲漏。當(dāng)腸道屏障受損時(shí),會(huì)導(dǎo)致腸道對(duì)鈣的吸收和利用降低,從而影響骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)[39]。

盡管有大量臨床研究表明腸道菌群失調(diào)與骨質(zhì)流失存在相關(guān)性,但這可能只是骨質(zhì)疏松患者的臨床體征,并不能表明腸道菌群與骨密度之間存在因聯(lián)系。首先,正如前文所說RCT可能受到混雜因素和反向因果等因素影響,同時(shí)部分研究結(jié)果是通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得的,與人體內(nèi)腸道菌群的構(gòu)成存在差異,這些影響結(jié)果的可信度。其次,由于不同研究中受試者性別比例、環(huán)境、種族和飲食結(jié)構(gòu)的不一致,可能導(dǎo)致腸道菌群的組成存在差異而影響到研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。最后,盡管有研究表明骨質(zhì)疏松癥患者存在腸道菌群失衡的表型,但對(duì)于特定菌株變化的結(jié)果并不一致。這些不確定因素的存在阻礙對(duì)腸道菌群與骨質(zhì)疏松癥風(fēng)險(xiǎn)之間因果關(guān)系的推斷。本研究與以往觀察性研究不同的是利用孟德爾隨機(jī)化研究為證明“腸-骨”軸理論提供了一種新的方法。一方面,孟德爾隨機(jī)化研究減少了混雜因素與反向因果的影響,極大地提高了研究結(jié)果的準(zhǔn)確性;另一方面,在研究者方面筆者主要使用歐洲人群數(shù)據(jù),將研究參與者限制為歐洲血統(tǒng),能夠最大程度減少環(huán)境、種族和飲食結(jié)構(gòu)等差異造成的結(jié)果偏倚。最重要的是,腸道微生物群的遺傳變異是從最大的可用GWAS薈萃分析中獲得的,這種大樣本量?jī)?yōu)勢(shì)確保了MR分析中IVs的強(qiáng)度以及研究結(jié)果的穩(wěn)健性。

雖然本研究提供了有價(jià)值的見解,但這項(xiàng)研究也存在一些局限性,在解釋結(jié)果時(shí)應(yīng)注意。首先,孟德爾隨機(jī)化通常僅考慮一個(gè)或兩個(gè)變量。但實(shí)際情況往往非常復(fù)雜,還可能有其他變量或交互作用會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其次,本研究使用的全基因組關(guān)聯(lián)研究匯總數(shù)據(jù)庫并缺乏個(gè)體層面數(shù)據(jù),限制了進(jìn)行按年齡、性別、疾病持續(xù)時(shí)間、治療和疾病類型等變量進(jìn)行亞組分析的能力。這使得在亞組之間比較因果效應(yīng)的差異變得困難。因此,孟德爾隨機(jī)化雖然是一種常用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,但也有其局限性。在實(shí)際應(yīng)用中,需要結(jié)合實(shí)際情況,綜合考慮多種因素,以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

綜上所述,本研究采用了孟德爾隨機(jī)化分析來探討腸道菌群與骨密度之間的因果關(guān)系。研究結(jié)果顯示二者存在因果聯(lián)系,提示在臨床骨質(zhì)疏松癥治療中需關(guān)注對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)。