魏 芹, 趙曉鵬, 于華林, 燕彩霞

(山東省濟(jì)南市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院, 1. 內(nèi)分泌, 2. 骨二科, 3. 肝病內(nèi)科, 4. 腫瘤科, 山東 濟(jì)南, 271100)

糖尿病心肌病(DCM)是世界范圍內(nèi)心力衰竭的重要原因[1], 其發(fā)病機(jī)制涉及心臟炎癥、氧化應(yīng)激、心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡等方面[2]。全國老中醫(yī)藥專家陳樹泉認(rèn)為, DCM的基本病機(jī)是久病入絡(luò),辛溫通絡(luò)為其基礎(chǔ)治法。心肌細(xì)胞凋亡增加是DCM發(fā)生的直接原因之一[3],且越來越多的證據(jù)表明糖尿病患者心肌細(xì)胞凋亡水平升高,引起心肌細(xì)胞減少和心功能不全[4]。因此,抑制心肌細(xì)胞凋亡的藥物或可作為DCM的潛在治療藥物。麝香酮是人造麝香的主要活性成分,作為辛溫通絡(luò)治療中的代表性藥物,其具有抗腦缺血、抗炎、抗氧化等藥理作用[5]。相關(guān)研究[6]顯示,麝香酮可通過抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡來緩解大鼠心肌缺血再灌注損傷,表明麝香酮具有心肌保護(hù)作用。另有研究[7]顯示,抑制脂肪酸合成酶(Fas)/脂肪酸合成酶配體(FasL)通路可緩解2型糖尿病大鼠心肌損傷。但麝香酮能否通過調(diào)控Fas/FasL信號通路而影響DCM大鼠心肌細(xì)胞凋亡目前尚不明確。本研究探討麝香酮對DCM大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性SD大鼠(考慮到雌激素對DCM具有保護(hù)作用[8], 為了更好地體現(xiàn)藥物作用,故僅選用雄性大鼠)72只, 6周齡,體質(zhì)量210～220 g, 購自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司桐鄉(xiāng)分公司,生產(chǎn)許可證號為SCXK(浙)2020-0002。本研究得到濟(jì)南市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動物倫理委員會審核批準(zhǔn),且所有動物實(shí)驗(yàn)遵循3R原則。

1.2 主要試劑

麝香酮購自滁州仕諾達(dá)生物科技有限公司; 鏈脲佐菌素購自上海西唐生物科技有限公司; 二甲雙胍購自中美上海施貴寶制藥有限公司; 重組人FasL蛋白(rh-FasL)(Fas/FasL通路激活劑)購自湖北艾普蒂生物工程有限公司; Masson染色試劑盒購自無錫云萃生物科技有限公司; 大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司; 兔源一抗裂解的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved-caspase-3)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、Fas、FasL、GAPDH及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購自英國Abcam公司。

1.3 DCM大鼠模型構(gòu)建

采用高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素方式構(gòu)建DCM大鼠模型[9], 即用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠4周后,禁食12 h, 再一次性腹腔注射30 mg/kg鏈脲佐菌素, 3 d后若大鼠空腹血糖高于16.7 mmol/L, 表明DCM大鼠模型構(gòu)建成功。

1.4 動物分組及處理

按照隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠隨機(jī)分為空白組、DCM組、麝香酮低劑量組、麝香酮高劑量組、二甲雙胍組、麝香酮高劑量+rh-FasL組,每組12只。除空白組外,其他組均構(gòu)建DCM大鼠模型,建模成功后進(jìn)行給藥處理, 1次/d給藥,持續(xù)6周。麝香酮低劑量組、麝香酮高劑量組[10]、二甲雙胍組[11]大鼠分別灌胃0.68 mg/kg麝香酮、2.72 mg/kg麝香酮、140 mg/kg二甲雙胍,且均腹腔注射等體積生理鹽水; 麝香酮高劑量+rh-FasL組[12]大鼠灌胃2.72 mg/kg麝香酮,且腹腔注射0.017 mg/kg rh-FasL; 空白組、DCM組大鼠均灌胃等體積生理鹽水,且腹腔注射等體積生理鹽水。

1.5 空腹血糖及左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)檢測

末次處理結(jié)束后,取全部大鼠,禁食、禁水12 h后,先使用動物血糖儀檢測大鼠空腹血糖,然后使用彩色多普勒超聲顯像儀檢測LVEF、LVFS。

1.6 標(biāo)本收集方法

2%戊巴比妥鈉麻醉后處死大鼠,收集大鼠心肌組織,分為2份(每份包含6只大鼠的心肌組織),一份固定于4%多聚甲醛中用于蘇木素-伊紅(HE)染色、Masson染色和TUNEL染色,另一份凍存于-80 ℃環(huán)境用于氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測和蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)實(shí)驗(yàn)。

1.7 HE染色法、Masson染色法檢測大鼠心肌組織病理損傷、纖維化程度

將固定于4%多聚甲醛中的心肌組織室溫下脫水,包埋在石蠟中,切成5 μm厚切片。對切片進(jìn)行HE染色或Masson染色,于光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理變化,通過ImageJ軟件計算心肌膠原面積,心肌膠原面積分?jǐn)?shù)(%)=心肌膠原面積/整個視野面積×100%。

1.8 大鼠心肌組織SOD活性及MDA含量檢測

嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測大鼠心肌組織中SOD活性及MDA含量。

1.9 TUNEL染色法檢測心肌細(xì)胞凋亡

取1.7中的切片利用蛋白酶K試劑透化15 min后,加入TdT反應(yīng)緩沖液37 ℃孵育10 min, 再與TUNEL試劑共同避光孵育30 min, 最后加入DAPI染料對細(xì)胞核進(jìn)行染色,使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞染色情況。細(xì)胞凋亡率(%)=TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/DAPI陽性細(xì)胞數(shù)×100%。

1.10 Western blot檢測大鼠心肌組織中Cleaved-caspase-3、Bax、Fas、FasL蛋白表達(dá)

將心肌組織在含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液中勻漿,并將勻漿在4 ℃條件下以14 000 g離心20 min。蛋白質(zhì)濃度采用二喹啉甲酸(BCA)法測量。將等量蛋白質(zhì)經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后,用5%脫脂奶粉封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn), 4 ℃條件下與一抗Cleaved-caspase-3(1∶3 000)、Bax (1∶4 000)、Fas(1: 3 000)、FasL(1∶3 000)、GAPDH(1∶4 000)孵育過夜。用TBST緩沖液洗滌后,將膜與二抗(1∶4 000)孵育2 h。使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑觀察蛋白印跡,應(yīng)用ImageJ軟件對蛋白圖像進(jìn)行定量分析。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠空腹血糖及LVEF、LVFS比較

與空白組比較, DCM組大鼠空腹血糖升高, LVEF、LVFS降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與DCM組比較,麝香酮低劑量組、麝香酮高劑量組、二甲雙胍組大鼠空腹血糖降低, LVEF、LVFS升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與麝香酮低劑量組比較,麝香酮高劑量組、二甲雙胍組大鼠空腹血糖降低, LVEF、LVFS升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與麝香酮高劑量組比較,麝香酮高劑量+rh-FasL組大鼠空腹血糖升高, LVEF、LVFS降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見表1。

表1 各組大鼠空腹血糖及心臟功能指標(biāo)LVEF、LVFS比較

2.2 各組大鼠心肌組織病理損傷及心肌纖維化

HE染色結(jié)果顯示,空白組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)正常; DCM組大鼠心肌組織中心肌細(xì)胞排列紊亂,有大量炎性細(xì)胞浸潤; 與DCM組比較,麝香酮低劑量組、麝香酮高劑量組、二甲雙胍組大鼠心肌組織病理損傷減輕; 與麝香酮高劑量組比較,麝香酮高劑量+rh-FasL組大鼠心肌組織病理損傷加重,見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色和Masson染色光學(xué)顯微鏡圖像(放大200倍)

Masson染色結(jié)果顯示, DCM組大鼠心肌膠原面積分?jǐn)?shù)高于空白組,麝香酮低劑量組、麝香酮高劑量組、二甲雙胍組大鼠心肌膠原面積分?jǐn)?shù)低于DCM組,麝香酮高劑量組、二甲雙胍組大鼠心肌膠原面積分?jǐn)?shù)低于麝香酮低劑量組,麝香酮高劑量+rh-FasL組大鼠心肌膠原面積分?jǐn)?shù)高于麝香酮高劑量組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖1、表2。

表2 各組大鼠心肌膠原面積分?jǐn)?shù)比較 %

2.3 各組大鼠心肌組織中SOD活性和MDA含量

與空白組比較, DCM組大鼠心肌組織中SOD活性降低, MDA含量升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與DCM組比較,麝香酮低劑量組、麝香酮高劑量組、二甲雙胍組SOD活性升高, MDA含量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與麝香酮低劑量組比較,麝香酮高劑量組、二甲雙胍組SOD活性升高, MDA含量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與麝香酮高劑量組比較,麝香酮高劑量+rh-FasL組SOD活性降低, MDA含量升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見表3。

表3 各組大鼠心肌組織中SOD活性和MDA含量比較

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較

DCM組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率高于空白組,麝香酮低劑量組、麝香酮高劑量組、二甲雙胍組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率低于DCM組,麝香酮高劑量組、二甲雙胍組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率低于麝香酮低劑量組,麝香酮高劑量+rh-FasL組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率高于麝香酮高劑量組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖2、表4。

圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡的TUNEL染色結(jié)果(放大200倍)

表4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較 %

2.5 各組大鼠心肌組織中Cleaved-caspase-3、Bax蛋白及Fas/FasL通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較

表5 各組大鼠心肌組織中Cleaved-caspase-3、Bax、Fas、FasL蛋白表達(dá)比較

與空白組比較, DCM組大鼠心肌組織中Cleaved-caspase-3、Bax、Fas、FasL蛋白表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與DCM組比較,麝香酮低劑量組、麝香酮高劑量組、二甲雙胍組Cleaved-caspase-3、Bax、Fas、FasL蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與麝香酮低劑量組比較,麝香酮高劑量組、二甲雙胍組Cleaved-caspase-3、Bax、Fas、FasL蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與麝香酮高劑量組比較,麝香酮高劑量+rh-FasL組Cleaved-caspase-3、Bax、Fas、FasL蛋白表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見圖3、表5。

圖3 各組大鼠心肌組織中相關(guān)蛋白表達(dá)的Western blot檢測結(jié)果

3 討 論

DCM是心力衰竭和猝死的危險因素[13], 其發(fā)病率隨著糖尿病患者例數(shù)的增加而升高。氧化應(yīng)激是DCM發(fā)病機(jī)制中的重要病理生理過程,包含SOD在內(nèi)的內(nèi)源性抗氧化劑系統(tǒng)受到高血糖的不利影響,引發(fā)進(jìn)行性氧化應(yīng)激損傷,改變線粒體膜通透性,導(dǎo)致促凋亡因子釋放,進(jìn)而引起心肌細(xì)胞凋亡[14-15]。MDA是由多不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)生的不飽和醛,可加重氧化應(yīng)激反應(yīng); SOD是氧化應(yīng)激的標(biāo)志物,可發(fā)揮抗氧化的作用[16]。本研究通過高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素方式構(gòu)建DCM大鼠模型后發(fā)現(xiàn),與空白組比較, DCM組大鼠空腹血糖升高, LVEF、LVFS降低,心肌組織病理損傷及心肌纖維化嚴(yán)重,提示DCM大鼠模型構(gòu)建成功。本研究還發(fā)現(xiàn),與空白組比較,DCM組大鼠心肌組織中SOD活性降低,MDA含量、心肌細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase-3、Bax表達(dá)升高,表明DCM大鼠存在氧化應(yīng)激及心肌細(xì)胞凋亡。

全國老中醫(yī)藥專家陳樹泉認(rèn)為, DCM的基本病機(jī)是久病入絡(luò),應(yīng)以“辛溫通絡(luò)”為治療大法。麝香味辛溫,《雷公炮制藥性解》提到“麝香為諸香之最,其氣透入骨髓,故于經(jīng)絡(luò)無所不入”,《得配本草》提到“麝香,通關(guān)竅,開經(jīng)絡(luò),透肌骨,安心神”。以麝香為君藥的麝香保心丸已被證實(shí)對DCM患者心臟功能具有改善作用,還能抑制炎性反應(yīng),減輕臨床癥狀。麝香酮是中藥麝香的主要成分,具有抗氧化、抗炎和抗凋亡的特性[17]。據(jù)報道[18-19], 麝香酮通過抗纖維化、抗凋亡來增強(qiáng)心肌梗死小鼠的運(yùn)動耐力,且可抑制糖尿病周圍神經(jīng)病變過程中雪旺細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果顯示,麝香酮可抑制DCM大鼠氧化應(yīng)激及心肌細(xì)胞凋亡,且麝香酮劑量越高,抑制作用越明顯。二甲雙胍是臨床常用的DCM治療藥物[20], 本研究以該藥物作為陽性藥物,發(fā)現(xiàn)高劑量麝香酮與二甲雙胍對DCM大鼠氧化應(yīng)激及心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用無顯著差異,提示麝香酮能抑制DCM大鼠氧化應(yīng)激及心肌細(xì)胞凋亡,可能成為治療DCM的潛在有效藥物。

作為一種經(jīng)典的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)劑, Fas與FasL結(jié)合后,可導(dǎo)致具有死亡結(jié)構(gòu)域的Fas相關(guān)蛋白募集到致死信號傳導(dǎo)復(fù)合物中而引起細(xì)胞凋亡[21]。據(jù)報道,抑制Fas/FasL通路可減輕大鼠心肌缺血再灌注過程中氧化應(yīng)激反應(yīng)造成的心肌損傷[22-23], 激活Fas/FasL通路則可誘導(dǎo)阿霉素處理的大鼠心肌細(xì)胞凋亡[24-25]。本研究結(jié)果顯示,與空白組大鼠比較, DCM大鼠心肌組織中Fas、FasL蛋白表達(dá)升高,而經(jīng)麝香酮干預(yù)后, DCM大鼠心肌組織中Fas、FasL蛋白表達(dá)降低,故推測麝香酮可能通過抑制Fas/FasL通路而抑制DCM大鼠氧化應(yīng)激及心肌細(xì)胞凋亡。為了驗(yàn)證該推測,本研究在高劑量麝香酮作用的基礎(chǔ)上加用Fas/FasL通路激活劑rh-FasL干預(yù)DCM大鼠,結(jié)果顯示, rh-FasL減弱了高劑量麝香酮對DCM大鼠氧化應(yīng)激及心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用,證實(shí)麝香酮可能通過抑制Fas/FasL通路而抑制DCM大鼠氧化應(yīng)激及心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述,麝香酮可能通過抑制Fas/FasL通路抑制DCM大鼠氧化應(yīng)激及心肌細(xì)胞凋亡。但麝香酮對DCM大鼠氧化應(yīng)激及心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用可能還涉及其他通路,未來還需進(jìn)一步深入研究加以探討。