陳 瑤 鄭才斌

福建醫(yī)科大學附屬南平第一醫(yī)院檢驗科，福建南平 353000

白色念珠菌（Candida albicans）是一種常見的機會致病菌，常寄生在正常人的皮膚表面、口腔、胃腸道、陰道黏膜等位置而不發(fā)生疾病[1-2]。近年來，由于社會老齡化問題愈來愈嚴重、多種廣譜抗生素的濫用、人體免疫功能下降等原因，導致感染白色念珠菌的人數逐年升高[3-4]。調查發(fā)現，白色念珠菌是真菌感染常見致病菌，同時也是導致院內獲得性念珠菌感染的主要病原體[5-6]。目前有很多方法可用于鑒定白色念珠菌[7-8]，包括基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser-desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）和內轉錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列分析方法。MALDI-TOF MS 作為一種新興的微生物蛋白圖譜鑒定系統(tǒng)，因其具有快速檢測的優(yōu)勢，近年來逐漸受到廣泛關注[9]。分析比較不同科室分離的白色念珠菌的親緣關系，可以清楚的看出它的傳播特點和流行情況，為有效抑制真菌擴散與感染爆發(fā)提供依據。因此，準確、快速地診斷念珠菌感染以及對其進行流行病學調查，對于預防和治療侵襲性真菌感染具有重要的臨床價值。本研究通過回顧性分析2011 年1 月至2016年12 月臨床無菌部位分離的白色念珠菌，分別用不同方法鑒定并進行比較分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 標本來源

回顧性分析2011 年1 月至2016 年12 月福建醫(yī)科大學附屬南平第一醫(yī)院從臨床無菌部位（血液、腦脊液、胸腹水、穿刺液、引流液等）分離出的173 株白色念珠菌，均為各個科室送檢的血培養(yǎng)陽性念菌株；均進行同樣的方式檢驗；將同一患者同一部位檢出的標本或者同一患者不同部位反復檢出的相同標本剔除，記錄好患者的基本資料和菌株信息。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定 將收集到的菌株進行復蘇，沙保羅瓊脂平板在35℃孵育箱培養(yǎng)24 ～48 h，挑選菌落進行MALDI-TOF MS（德國布魯克公司）鑒定和ITS 測序鑒定。

1.2.2 同源性分析

1.2.2.1 多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST） （1）引物合成：從http://www.mlst.net/網站中獲取7 個管家基因位點的引物信息，委托英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。引物信息見表1。

表1 白色念珠菌7個管家基因的片段長度和引物序列

用以上引物進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，并行瓊脂糖凝膠電泳，再將擴增后的陽性產物送至鉑尚生物技術有限公司進行測序，就可得到菌株的序列型（sequence typing，ST 型）和基因位點分型。

（2）系統(tǒng)發(fā)育分析：①基于位點序列的系統(tǒng)發(fā)育分析。用clustalX 軟件，將上述測序數據進行比對，然后用MEGA4 軟件進行菌株的序列多重比對，最后用鄰接法、最大簡約法等構建進化樹。②基于位點型別的系統(tǒng)發(fā)育分析。用eBURST 的方法，將上述得到的7 個管家基因的基因位點型別進行聚類分析，至少有4 個基因位點相同的型別可分到同一eBURST 群中。

1.2.2.2 MALDI Biotyper 同源性分析 （1）聚類分析[主譜圖預測（main spectra projection，MSP）]：125 株菌株可以生成125 個MSP，Selected MSP 窗口下選中全部MSP，右擊MSP Dendrogram，即可生成聚類分析圖。

（2）主成分分析（principal compontent analysis，PCA）：分析菌株的原始數據，結果用View Clustering 圖形顯示。

1.3 統(tǒng)計學分析

實驗數據采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行處理，計量資料以均數±標準差（）表示，采用t檢驗，計數資料以[n（%）]表示，用χ2檢驗，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ITS測序結果

通過ITS 測序鑒定后，173 株白色念珠菌只有125 株鑒定準確，PCR 電泳圖見圖1。

2.2 不同鑒定方法的結果比對

通過不同方法鑒定后，173 株白色念珠菌只有125 株鑒定準確，結果見表2。

表2 不同鑒定方法的結果比較

2.3 白色念珠菌的菌株分布特征

用上述方法鑒定準確的125 株白色念珠菌，分別來自125 例不同患者，男83 例（83/125，66.40%），女42 例（42/125，33.60%），年齡中位數為59 歲，平均（51.35±6.54）歲。引流液和血液是標本來源中最多的兩種類型，分別占43 例（43/125，34.40%）和40 例（40/125，32.00%），最少的為腦脊液（1/125，0.80%）?？剖曳植贾幸灾匕Y醫(yī)學科占最多有47 例（47/125，37.60%），排在第二的為基本外科占21 例（21/125，16.80%）。

2.4 MLST分型

125 株白色念珠菌經MLST 分型后可得到61 個序列型（ST 型），其中最多的序列型為ST3160（8 株）和ST1474（9 株），其次是ST2059（7 株）和ST1450（7株）。在7 個管家基因位點中，VPS13 基因與SYA1基因依次分出24 個和19 個型別，分型效率居前兩位，ACC1 基因分出8 個型別，分型效率最低。

3 討論

多年來，深部真菌一直是院內感染的關鍵致病微生物之一。對年齡分布的分析表明，60 ～79 歲年齡段的患者數量最多，占總數的一半以上，其中60 ～69 歲患者占比高達24.80%。這一趨勢與已有文獻的研究結果一致[10-11]，強調了老年人更容易感染白色念珠菌的事實。這一現象可以追溯到多個因素：首先，老年人隨著年齡增長，各個器官系統(tǒng)的功能逐漸減弱，是感染高發(fā)群體；其次，老年人通常伴隨多種基礎性疾病，可能服用影響免疫的藥物，或因住院時間較長而接受侵入性操作，這些因素都導致免疫功能的下降，促使真菌在體內滋生，引發(fā)二次感染[12]。值得特別強調的是，在本研究中，源自血液感染的白色念珠菌感染占比高達32.00%。根據報道[13]，真菌血癥病死率最高可超過70%，早期及時對疑似感染患者行真菌鏡檢及培養(yǎng)是挽救生命體的關鍵。本研究發(fā)現白色念珠菌感染的發(fā)病率在不同臨床科室之間存在差異，其中重癥醫(yī)學科的發(fā)病率最高，達到37.60%，這與先前的文獻報道[14]一致。在重癥醫(yī)學科，白色念珠菌高發(fā)的主要原因是醫(yī)源性因素，如氣管插管、中心靜脈導管的置入、留置導尿管等侵入性操作，外科大手術等。此外，基本外科科室中，肝膽外科檢出率也相對較高，通常伴隨創(chuàng)傷性大手術。因此，迫切需要尋找快速而準確的鑒定方法，以便對真菌感染進行診斷和治療。

本研究結果表明，針對致病性念珠菌的鑒定，MALDI-TOF MS 與ITS 測序結果相比，在準確性上無明顯差異，但其具有更短的檢測時間和更低的成本，因此被視為一種迅速、便捷、精確的鑒定方法。有研究者認為，真菌科瑪嘉顯色培養(yǎng)存在技術局限，可能導致誤導性的鑒定和治療錯誤。原因分析：①不同人對顏色的分辨能力存在差異，導致對于類似的顏色，如紫紅色、藍色、藍灰色、藍紫色的識別存在差異；②常見菌株在科瑪嘉顯色后的顏色可能缺乏典型；③研究中所包含的不同菌種構成比例不同；④少見與常見菌株的相似性。這反映了科瑪嘉顯色培養(yǎng)方法在結果解釋方面存在一定的主觀性，容易導致誤判情況的發(fā)生。因此，為了獲得準確的結果，需要將科瑪嘉顯色培養(yǎng)與其他鑒定方法結合使用[15-16]。

以MALDI-TOF MS 鑒定念珠菌，方法和原理完全有別于傳統(tǒng)方法，不再需要提取DNA 和測序。鑒別單個樣本所需的時間僅為幾分鐘，極大地提高了工作效率，成本低且操作簡便。在本研究中，此法鑒定念珠菌級別準確度高達100.00%，并且與ITS 測序結果完全一致。這一結果與已有文獻研究[17]的結論一致，肯定了此法鑒定精準、低成本、高效率的特點。

分子生物學技術在臨床和科研領域得到廣泛應用，通常被視為評估其他真菌鑒定方法的“黃金標準”。本研究通過ITS 測序準確地確定了酵母樣真菌的種屬，覆蓋了12 個不同的真菌種類。盡管分子生物學技術在真菌鑒定方面取得了顯著進展，但仍存在一些挑戰(zhàn)。真菌基因數據庫尚不完善，同時，不同真菌DNA 提取尚缺乏統(tǒng)一規(guī)范，這可能導致較高的成本和較長的操作時間。因此，許多臨床實驗室目前尚未具備進行這項技術的實驗條件，相關研究尚處于實驗階段，尚未在臨床實踐中得到廣泛應用。

綜上，MALDI-TOF MS 鑒定念珠菌準確度與ITS 測序相近，而且具有更高的效率、較低的成本，是一種快速、便捷、準確的致病性念珠菌鑒定方法。此外，兩種方法的同源性分析結果基本一致，這表明在臨床實驗室中廣泛采用MALDI-TOF MS 是合理的。然而，本研究也存在一些限制，包括樣本數量有限和研究時間較短。未來的深入研究將有助于更全面地驗證MALDI-TOF MS 在念珠菌鑒定中的準確度。