周芷伊 趙 莉 王衡新 蔣飛榮 舒長宏 鄧姣梅 潘任桃 鄧友田

1.天地恒一制藥股份有限公司，湖南長沙 410331；2.湖南安生美藥物研究院有限公司，湖南長沙 410000

活絡(luò)消痛膠囊是由刺五加浸膏、威靈仙、當歸、制川烏、制草烏等10 味藥材組成的傳統(tǒng)中藥制劑，具有通經(jīng)活絡(luò)、舒筋止痛的功效。用于風(fēng)寒濕痹，經(jīng)絡(luò)閉塞，筋骨疼痛，四肢麻木。據(jù)文獻報道，活絡(luò)消痛膠囊治療膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）具有較好的臨床療效[1-3]，此外，還可用于治療頸椎病[4]及糖尿病周圍神經(jīng)病變等慢性疾病[5]。

KOA 具有發(fā)病率高、病程長、階梯性明顯、對生活質(zhì)量影響大等特點[6-9]?；罱j(luò)消痛膠囊治療此類疾病需長期反復(fù)用藥，但其安全性數(shù)據(jù)暫無報道，無法確認長期用藥對身體造成的影響，大多中成藥目前仍存在安全性信息尚不明確的問題，這在一定程度上影響了其療效與安全性[10-11]。為初步探討其臨床用藥安全性，本研究開展活絡(luò)消痛膠囊單次給藥和6 個月重復(fù)給藥毒性試驗研究，判斷藥物的蓄積毒性反應(yīng)、劑量毒性效應(yīng)關(guān)系、毒性靶器官及可逆性，推測重復(fù)用藥的安全劑量范圍，提示臨床試驗中需重點監(jiān)測的指標，以便為臨床長期用藥提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

ME1002E 型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]、DF50Vet 型動物用五分類血液細胞分析儀（深圳市帝邁生物技術(shù)有限公司）、BS-430 型全自動生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）、K-Lite6B 型電解質(zhì)分析儀（梅州康立高科技有限公司）、C3100 型全自動凝血分析儀（北京普利生儀器有限公司）、URIT-150Vet 型動物尿液分析儀（桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司）、ECLIPSECi-L 型尼康生物正置顯微鏡（NIKON）、ImageViewDS-1600 型成像系統(tǒng)（杭州圖譜光電科技有限公司）

1.2 藥品與試劑

活絡(luò)消痛膠囊（天地恒一制藥股份有限公司，批號：201401），臨床擬用劑量：一次4 粒，一日3 次，0.35 g/粒，4.20 g 內(nèi)容物/d，每0.35 g 膠囊內(nèi)容物相當于0.66 g 生藥，成人日服生藥量為7.92 g 生藥/d。

異氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批號：1902801）、血細胞分析用溶血劑LYF-1（深圳市帝邁生物技術(shù)有限公司，批號：2021022201）、血細胞分析用稀釋液（深圳市帝邁生物技術(shù)有限公司，批號：2021090401）、血細胞分析儀用質(zhì)控物（深圳市帝邁生物技術(shù)有限公司，批號：BC1121）、質(zhì)控血清（RANDOX，批號：1396UN）、電解質(zhì)測定試劑（梅州康立高科技有限公司，批號：DE21060001）、電解質(zhì)質(zhì)控品（梅州康立高科技有限公司，批號：L21020001）、UQ 尿質(zhì)控液（桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司，批號：55210100）。

1.3 實驗動物

SD 大鼠40 只，SPF 級，雌雄各半，體質(zhì)量181.50 ～207.40 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物質(zhì)量合格證號：No.430727211100809045，倫理審查編號：IACUC-2021CY2016ATS2；SD 大鼠160 只，SPF 級，體重：180.20 ～219.90 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物質(zhì)量合格證號：No.430727211100865621，倫理審查編號：IACUC-2021CY2017CTS2。二者生產(chǎn)許可證編號：SCXK（湘）2019-0004，使用許可證號：SYXK（湘）2018-0004。購入后檢疫適應(yīng)環(huán)境5 ～6 d，對動物外觀健康、臨床癥狀等情況觀察，各項指標達到試驗要求，經(jīng)湖南安生美藥物研究院有限公司實驗動物管理（倫理）委員會審查、批準后實施。

1.4 方法

1.4.1 急性毒性試驗 采用最大給藥量法，選用SD 大鼠，40 只，雌雄各半，體重181.50 ～207.40 g，按體重性別區(qū)段隨機分為空白對照組、活絡(luò)消痛膠囊組，每組各20 只。受試物最大濃度為0.40 g 內(nèi)容物/ml，最大給藥量30.20 g 生藥/kg，相當于人臨床擬用劑量267 倍。受試物與去離子水按20 ml/kg分別經(jīng)口灌胃，實驗前禁食不禁水12 h 以上，給藥當日給藥2 次（兩次給藥間隔約6 h，兩次給藥間禁食不禁水）。給藥當天密切觀察并記錄各組大鼠的中毒表現(xiàn)和特點、毒性反應(yīng)出現(xiàn)及恢復(fù)時間以及死亡情況等，然后每天觀察2 次（上、下午各1 次），連續(xù)觀察14 d 動物臨床癥狀。分別于給藥當日給藥前及給藥后第4、7、10、14 天對大鼠體重進行稱量，第15 天解剖大鼠，進行大體觀察。

1.4.2 長期毒性試驗 選用檢疫合格的SD 大鼠160 只，體重180.20 ～219.90 g，雌雄各半，按體重采用區(qū)段隨機分為空白對照組及活絡(luò)消痛膠囊低、中、高劑量組，每組各40 只。本品臨床擬用劑量為4.20 g 內(nèi)容物/ d，成人按平均體重70 kg 計?；罱j(luò)消痛膠囊高、中、低三個劑量組（11.30、5.70、2.80 g 生藥/kg）分別約相當于人日服用劑量的100、50、25 倍，同時設(shè)空白對照組（去離子水），給藥體積均為15 ml/kg，每天1 次，每周7 d，連續(xù)26 周，恢復(fù)期停藥觀察4 周。給藥3 個月、停藥4 周按計劃各組分別解剖10 只大鼠，雌雄各半。給藥6 個月，按計劃各組分別解剖20 只大鼠，雌雄各半。檢查項目包括：一般臨床觀察；體重、攝食量測定；眼科檢查；尿液檢查；血液學(xué)、血液生化、電解質(zhì)、凝血及臟器系數(shù)測定；組織病理學(xué)檢查。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較滿足正態(tài)性和方差齊性時采用t檢驗，數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)性時采用Mann-Whitney Test，系統(tǒng)解剖及組織病理學(xué)采用定性指標判斷結(jié)果。P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜ 0.01 為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠急性毒性試驗結(jié)果

給藥后連續(xù)觀察14 d，空白對照組和活絡(luò)消痛膠囊組大鼠自主活動、精神狀態(tài)和飲食情況均未見明顯異常，未見相關(guān)毒性反應(yīng)及動物死亡，大體解剖肉眼觀察各器官均未見明顯異常情況。給藥后14 d 內(nèi)稱重，活絡(luò)消痛膠囊組與同期空白對照組動物體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），見表1。

表1 急性毒性試驗中大鼠體重變化情況比較（g，）

表1 急性毒性試驗中大鼠體重變化情況比較（g，）

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2.2 長期毒性試驗

2.2.1 活絡(luò)消痛膠囊對一般狀況的影響 給藥期和恢復(fù)期觀察期間，活絡(luò)消痛膠囊各劑量組與同期空白對照組比較，動物的外觀體征、行為活動及動物的一般狀況等未出現(xiàn)與藥物毒性相關(guān)的異常。

2.2.2 活絡(luò)消痛膠囊對體重的影響 試驗期間活絡(luò)消痛膠囊各劑量組與同期空白對照組比較，高劑量組雄性大鼠的體重明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），但經(jīng)4 周停藥觀察期可恢復(fù)。見表2。

表2 長期毒性試驗中大鼠體重變化情況比較（g，）

表2 長期毒性試驗中大鼠體重變化情況比較（g，）

注 與空白對照組比較，aP ＜ 0.05，aaP ＜ 0.01

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2.2.3 活絡(luò)消痛膠囊對尿液指標的影響 活絡(luò)消痛膠囊給藥6 個月，與空白對照組比較中劑量組隱血賦值及高劑量組尿比重差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），但無明顯的量效關(guān)系，見表3。

表3 長期毒性試驗中活絡(luò)消痛膠囊對大鼠尿液指標的影響（）

表3 長期毒性試驗中活絡(luò)消痛膠囊對大鼠尿液指標的影響（）

注 與空白對照組比較，aaP ＜ 0.01；“-”為陰性

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2.2.4 活絡(luò)消痛膠囊對血常規(guī)、生化指標、電解質(zhì)、凝血指標的影響 活絡(luò)消痛膠囊各劑量組血常規(guī)指標血小板計數(shù)、網(wǎng)織紅細胞計數(shù)、嗜堿性細胞比例與同期空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），但無明顯的劑量、時間關(guān)系。生化指標丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、三酰甘油（triglycerides，TG）、γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶（gamma-glutamyltransferase，GGT）、葡萄糖（glucose，GLU）等與同期空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05 或P＜ 0.01），但無明顯量效關(guān)系。電解質(zhì)鈉、鉀、氯與同期空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。凝血指標中活化部分凝血活酶時間和血漿凝血酶時間與同期空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），但無明顯的劑量、時間關(guān)系，見表4 ～6。

表4 長期毒性試驗中活絡(luò)消痛膠囊對大鼠血常規(guī)的影響（）

注 與空白對照組比較，aP ＜ 0.05

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表5 長期毒性試驗中活絡(luò)消痛膠囊對大鼠血液生化指標的影響（）

注 與空白對照組比較，aP ＜ 0.05，aaP ＜ 0.01；ALT-天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；AST：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；ALP：堿性磷酸酶；GGT-γ：谷氨?；D(zhuǎn)移酶；BUN：尿素氮；GLU：葡萄糖；TG：三酰甘油；TBIL：總膽紅素

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表6 長期毒性試驗中活絡(luò)消痛膠囊對大鼠對電解質(zhì)及凝血指標的影響（）

表6 長期毒性試驗中活絡(luò)消痛膠囊對大鼠對電解質(zhì)及凝血指標的影響（）

注 與空白對照組比較，aP ＜ 0.05

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2.2.5 活絡(luò)消痛膠囊對眼科及臟器系數(shù)的影響 試驗期間活絡(luò)消痛膠囊各劑量組及空白對照組眼科檢查未見明顯異常。與同期空白對照組比較，中、高劑量組部分臟器系數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05或P＜ 0.01），雌性動物給藥6 個月中、高劑量組及雄性動物高劑量組給藥3 個月、給藥6 個月肝臟臟器系數(shù)異常顯示與時間、劑量有一定相關(guān)性，但停藥4 周恢復(fù)正常，見表7。

表7 長期毒性試驗中活絡(luò)消痛膠囊對大鼠尿臟器系數(shù)的影響（）

表7 長期毒性試驗中活絡(luò)消痛膠囊對大鼠尿臟器系數(shù)的影響（）

注 與空白對照組比較，aP ＜ 0.05，aaP ＜ 0.01

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2.2.6 大體解剖和病理檢查 大體觀察給藥3 個月、給藥6 個月和停藥4 周各組解剖的動物臟器顏色、大小、質(zhì)地均未見明顯病理改變；顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)肝臟、心臟及腎上腺等臟器可見組織病理學(xué)改變，但活絡(luò)消痛膠囊高劑量組與空白對照組比較，病變類型及病變動物數(shù)量、病變程度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），見圖1。

圖1 HLXT 對SD 大鼠肝臟組織病理學(xué)圖像示例（HE 染色，×200）

3 討論

活絡(luò)消痛膠囊為已上市多年中藥復(fù)方制劑，臨床多用于骨關(guān)節(jié)炎、頸椎病等慢性疾病[1-5]，需長期反復(fù)用藥，由當歸、制川烏、制草烏等10 味藥材組成，制川烏、制草烏均為有毒藥材，毒性靶器官主要是心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)[12-15]。為保證用藥安全，本研究按照《藥物單次給藥毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[16]《藥物重復(fù)給藥毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[17]對活絡(luò)消痛膠囊的毒性進行評價，闡明藥物的毒性作用、了解其毒性靶器官及重復(fù)接受藥物后的毒性特征，為上市后藥品提供安全性評價依據(jù)。

急性毒性試驗結(jié)果顯示，大鼠以最大給藥量經(jīng)口灌服活絡(luò)消痛膠囊，給藥累積劑量為30.20 g 生藥/kg（臨床給藥劑量的267 倍），動物未見相關(guān)毒性反應(yīng)及死亡，表明活絡(luò)消痛膠囊無急性毒性。長期給藥毒性試驗中，最大給藥劑量11.30 g 生藥/kg（臨床給藥劑量的100 倍），給藥6 個月，動物的外觀體征、行為活動及一般狀況等均良好無異常。與對照組比較，活絡(luò)消痛膠囊高劑量組雄性動物體重明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），但經(jīng)停藥4 周可恢復(fù)，綜合其他各檢測指標分析，造成因素可能是給予高濃度藥液，造成攝食量減少所致?；罱j(luò)消痛膠囊組與同期空白對照組比較對部分血常規(guī)、生化指標、電解質(zhì)、凝血指標及尿液指標差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），但無明顯的劑量、時間關(guān)系，故認為該變化無毒理學(xué)意義。與同期空白對照組比較，活絡(luò)消痛膠囊雌性動物給藥6 個月中、高劑量組及雄性動物高劑量組給藥3個月、給藥6 個月肝臟臟器系數(shù)異常，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），且顯示與時間劑量有一定相關(guān)性，但停藥4 周恢復(fù)正常，結(jié)合解剖時大體觀察、病理檢查和血液生化檢查結(jié)果分析，未見明顯異常，故認為該差異無毒理學(xué)意義。大體解剖觀察結(jié)果和病理檢查各組別動物臟器均未見明顯異常，未發(fā)現(xiàn)活絡(luò)消痛膠囊對SD 大鼠有明顯的毒性作用。

綜上所述，活絡(luò)消痛膠囊無急性毒性及長期毒性，藥物的最大耐受量（maximal tolerance dose，MTD）≥30.2 g 生藥/kg，相當于人日服用劑量的267 倍；未觀察到臨床不良反應(yīng)的劑量水平（no observed adverse effect level，NOAEL）為11.3 g 生藥/kg，相當于人日服用劑量的100 倍，在治療劑量范圍內(nèi)用藥安全性高，長期重復(fù)服用無蓄積毒性，安全性風(fēng)險低。