鄭域茹 朱 錚 鄭 挺 高丹玲 廖燕萍

福建省食品藥品質(zhì)量檢驗研究院，福建福州 350001

醫(yī)院制劑是由醫(yī)療機構(gòu)根據(jù)臨床需要自行配制且經(jīng)藥品監(jiān)督管理部門審核批準后，按固定處方使用的制劑[1]。它能有效彌補市場藥物供應(yīng)不足，具有便捷、療效顯著且價格低廉等優(yōu)勢，是臨床用藥不可或缺的組成部分[2]。安樂陰洗劑是一種臨床常用的治療婦科疾病的醫(yī)院制劑，其處方由多種中草藥組成，具有清熱、解毒、燥濕、止癢的功效[3]。文獻報道，該洗液配方中的一枝黃花能明顯抑制大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及釀酒酵母[4]；制劑中的黃柏能抑制金黃色葡萄球菌、破傷風(fēng)桿菌及其他人體內(nèi)常見的致病菌[5]；蛇床子、綿馬貫眾、百部和花椒對細菌和真菌同樣具有一定程度的體外抑菌作用[6-7]。此外，該制劑還添加了各種防腐劑，如苯甲酸鈉和羥苯乙酯，這些防腐劑還具有很強的防腐作用。因此，安樂陰洗劑微生物限度檢查法的建立需要采用適當?shù)姆椒ㄏ志钚灾螅錂z查結(jié)果才能夠有效地反映其實際污染情況[8]。本研究應(yīng)用常規(guī)法、稀釋法、中和法、薄膜過濾法及中和-薄膜過濾法等摸索出消除安樂陰洗劑自身抑菌性的方法，以期建立合適的微生物限度檢驗方法，為該制劑的藥品質(zhì)量檢驗起到一定的借鑒作用，進而保障患者用藥安全。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器設(shè)備

TX2202L 電子天平（日本島津）、HVA-110 高壓蒸汽滅菌器（日本雅馬哈）、MSC1.8A2 生物安全柜（賽默飛世爾科技）、HTY-306A 過濾系統(tǒng)（浙江泰林）、IQ822C 培養(yǎng)箱（日本雅馬拓）和VITEK2 COMPACT 全自動微生物鑒定儀（梅里埃）等。

1.2 菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]、生孢梭菌[CMCC（B）64941]均購自中國食品藥品檢定研究院，傳代次數(shù)為第3 代。

1.3 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（tryptic soy agar，TSA）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（tryptic soy broth，TSB）和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Sabouraud dextrose agar，SDA）等均購于北京三藥科技有限公司，哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基和梭菌增菌液體培養(yǎng)基購自中國食品藥品檢定研究院。

1.4 稀釋劑與沖洗液

TSB；含4%聚山梨酯80 和0.5%大豆卵磷脂[9]的TSB；pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

1.5 供試品

安樂陰洗劑3 批（批號分別為221010、221014 和221020），均來源于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院。

2 方法

2.1 試驗用菌液的制備

按照《中國藥典》2020 年版[10]規(guī)定制備適宜濃度的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌懸液和梭菌的菌懸液。

2.2 需氧菌總數(shù)計數(shù)檢查方法的建立與驗證

方法A：1 ∶10 常規(guī)法。無菌量取安樂陰洗劑10 ml，加90 ml TSB，混勻，作為1 ∶10 供試液。分裝該供試液，取5 支無菌的試管，每支分裝9.9 ml，分別加入適宜濃度的菌懸液，控制最終每支試管中每毫升菌含量低于100 cfu，將此作為試驗組。將上述混合液2 ml 分別無菌吸取到直徑為90 mm 的無菌平皿中（1 ml/皿），然后注入TSA 培養(yǎng)基，置于30 ～35℃培養(yǎng)2 ～3 d，點計平板上的菌落數(shù)。以稀釋液替代菌液，其余操作方法與試驗組相同，作為供試品對照組；取稀釋液替代供試品溶液，其余操作方法與試驗組相同，作為菌液對照組。計算安樂陰洗劑中5 株試驗菌的回收率，回收率=（試驗組菌落數(shù)- 供試品對照組菌落數(shù)）/ 菌液對照組菌落數(shù)×100%。

方法B：1 ∶20 稀釋法。取方法A 項下的供試液50 ml，加入50 ml TSB，混勻，作為方法B 的供試液。其余操作同方法A。

方法C：1 ∶50 稀釋法。取方法A 項下的供試液20 ml，加入80 ml TSB，混勻，作為方法C 的供試液。其余操作同方法A。

方法D：中和法（1 ∶10）。將方法A 項下TSB稀釋液替換為含4%聚山梨酯80 和0.5%大豆卵磷脂的TSB，混勻，作為方法D 的供試液。用含4%聚山梨酯80 和0.5%大豆卵磷脂的TSB 代替TSB，作為中和劑對照組。其余操作同方法A。

2.3 霉菌和酵母菌計數(shù)檢查方法的建立與驗證

方法E：原液薄膜過濾法。取1 ml 供試品原液，加入100 ml pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液，混勻，加入1 ml 含菌量不大于100 cfu 的白色念珠菌菌懸液，采用HTY-306A 過濾系統(tǒng)過濾，隨后用pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗3 次，每次100 ml，濾干后將膜貼于SDA 平板后，置20 ～25℃培養(yǎng)3 d，點計濾膜上的菌落數(shù)。黑曲霉依照此法操作，最后對試驗菌的回收率進行計算。

方法F：薄膜過濾法。將方法E 項下1 ml 供試品原液替換為2.2 項下方法A 中以TSB 為稀釋劑的1 ∶10 供試液10 ml，其余操作參考方法E。

方法G：中和劑- 薄膜過濾法。將方法E 項下1 ml 供試品原液替換為2.2 項下方法D 中含有中和劑的1 ∶10 供試液10 ml，其余操作參考方法E。

2.4 控制菌檢查方法的建立與驗證

2.4.1 常規(guī)法 以TSB 為稀釋劑，制備1 ∶10 的供試液。金黃色葡萄球菌：取10 ml 供試液接種到TSB 增菌液（100 ml）中，同時接種的1 ml 金黃色葡萄球菌菌懸液（菌含量不超過100 cfu），混合均勻，按藥典規(guī)定培養(yǎng)觀察；銅綠假單胞菌：取10 ml 接種到TSB 增菌液（100 ml）中，同時接種1 ml 銅綠假單胞菌菌懸液（菌含量不超過100 cfu），混合均勻，按藥典規(guī)定培養(yǎng)觀察；白色念珠菌：取10 ml，接種到沙氏液體培養(yǎng)基（100 ml）中，同時接種1 ml白色念珠菌菌懸液（菌含量不超過100 cfu），混合均勻，按藥典規(guī)定的白色念珠菌檢查法培養(yǎng)觀察；梭菌：取10 ml，接種到梭菌增菌液（100 ml）中，同時接種1 ml 梭菌菌懸液（菌含量不超過100 cfu），混合均勻，按藥典規(guī)定的梭菌檢查法培養(yǎng)觀察。以不加菌懸液作為供試品對照組，以不加供試液作為陽性對照組，以稀釋液代替供試液且不加菌懸液作為陰性對照組。4 個控制菌方法適用性試驗中有疑似或典型菌落生長時，均采用微生物鑒定儀進行鑒定確認，根據(jù)鑒定結(jié)果確定試驗菌株是否檢出，并據(jù)此判斷方法適用性試驗是否可行。

2.4.2 中和法 將常規(guī)法中1 ∶10 供試液替換為2.2 項下方法D 制備的含中和劑的1 ∶10 供試液，其余操作參照2.4.1 的常規(guī)法。

3 結(jié)果

3.1 需氧菌總數(shù)計數(shù)預(yù)實驗

以批號為221010 的安樂陰洗劑開展預(yù)實驗，以TSB 作為稀釋劑的常規(guī)法（方法A），白色念珠菌的回收率為26%，枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌分別為39%和28%，均未達到50%，不符合藥典規(guī)定；方法B 將供試液稀釋倍數(shù)提高為1 ∶20，枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的回收率有所提高，分別為51%和50%，但是白色念珠菌的回收率僅為47%，仍未達到50%；方法C 將供試液按1 ∶50 的比例進一步稀釋，各試驗菌回收率在50%～200%，滿足適用性試驗回收率要求，但是白色念珠菌回收率仍偏低（僅為54%），顯然白色念珠對安樂陰洗劑最敏感；方法D 在稀釋劑TSB 中添加4%聚山梨酯80 和0.5%大豆卵磷脂制備1 ∶10 供試液后，白色念珠菌的回收率菌達79%，而其他各試驗菌的回收率均在90%～110%，表明供試液的抑菌性已基本消除。見表1。

表1 需氧菌總數(shù)計數(shù)預(yù)試驗結(jié)果

本研究采用稀釋法和中和法各試驗菌的回收率均符合《中國藥典》2020 年版[10]的規(guī)定。其中稀釋法需采用1 ∶50 的供試液，而中和法的供試液則為1 ∶10，依據(jù)《中國藥典》2020 年版[10]規(guī)定宜優(yōu)先選擇稀釋級更小的中和法對安樂陰洗劑需氧菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗。

3.2 需氧菌總數(shù)計數(shù)檢查方法適用性結(jié)果

基于3.1 的試驗結(jié)果，用中和法驗證三批供試品需氧菌總數(shù)計數(shù)的方法，三批樣品的5 種試驗菌回收率均符合《中國藥典》2020 年版[10]的規(guī)定（表2）。因此安樂陰洗劑的需氧菌總數(shù)計數(shù)法：以含有4%聚山梨酯80 和0.5%大豆卵磷脂的TSB作為稀釋劑制備1∶10供試液，采用平皿法（1 ml/皿）進行計數(shù)。

表2 需氧菌總數(shù)計數(shù)檢查方法適用性結(jié)果

3.3 霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)檢查方法適用性結(jié)果

在取供試品原液1 ml 薄膜過濾（方法E）試驗中，由于安樂陰洗劑原藥液中存在較多細小易散的沉淀，薄膜堵塞，無法進行試驗；而取TSB 為稀釋劑的1 ∶10 供試液10 ml 進行過濾（方法F），供試液中仍可見較多細小不溶物，薄膜過濾速度極為緩慢，難以進行試驗。方法G 中，以添加了4%聚山梨酯80 和0.5% 大豆卵磷脂的TSB 為稀釋劑，制備1 ∶10 試液，供試液變得肉眼可見澄清，取10 ml 進行薄膜過濾，堵膜現(xiàn)象明顯緩解，過濾速度大幅提高，pH 7.0 氯化鈉- 蛋白胨緩沖液沖洗3 次（100 ml/次），三批樣品的白色念珠菌和黑曲霉回收率均90%以上，符合《中國藥典》2020 年版[10]的規(guī)定。因此安樂陰洗劑的霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法：含4%聚山梨酯80 和0.5%大豆卵磷脂的TSB為稀釋劑制備1 ∶10 供試液，取10 ml 薄膜過濾，沖洗量300 ml/膜。見表3。

表3 霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法適用性結(jié)果

3.4 控制菌檢查方法適用性結(jié)果

4 種控制菌的檢查主要采用常規(guī)法和中和法進行考察（表4）。采用常規(guī)法對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和梭菌進行適用性試驗時，批號為221010的樣品試驗組的白色念珠菌和梭菌均未檢出，批號為221014 的樣品試驗組的金黃色葡萄球菌未檢出；當供試液中添加中和劑后，3 批樣品試驗組的金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和梭菌均生長良好，因此中和法適用于金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和梭菌的檢查。采用常規(guī)法和中和法對銅綠假單胞菌進行適用性試驗時，陽性對照組和3 批樣品試驗組的試驗菌均生長良好，陰性對照組無菌落生長，因此兩種方法均可用于銅綠假單胞菌的檢查。本研究中為了供試液制備的方便，銅綠假單胞菌檢查采用中和法進行。

表4 控制菌檢查方法適用性結(jié)果

綜上所述，安樂陰洗劑控制菌檢查方法：采用添加4%聚山梨酯80 和0.5%大豆卵磷脂的TSB為稀釋液制備1 ∶10 供試液，取10 ml 依相應(yīng)檢查法對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和梭菌進行檢查。

4 討論

中藥復(fù)方制劑，內(nèi)含多種對微生物具有抑制作用的成分，使用常規(guī)的微生物限度檢查法往往不適用，通常需要通過降低或去除樣品中抑菌作用，從而減少對檢驗結(jié)果的干擾，最大限度的避免漏檢、誤檢的情況[11-12]。本研究結(jié)果表明，安樂陰洗劑對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌具有不同程度的抑菌活性，故要建立可靠、穩(wěn)定的微生物限度檢查法必須排除該制劑的抑菌性，以保證檢驗結(jié)果真實有效[13-15]。

本研究采用稀釋法、中和法對安樂陰洗劑需氧菌總數(shù)計數(shù)進行方法優(yōu)化，稀釋法和中和法的5 株試驗菌的回收率均符合我國藥典要求，但是中和法能有效降低供試液稀釋級別。聚山梨酯80 和卵磷脂均為中國藥典收載的中和劑，分別為非離子型和兩性離子表面活性劑，可保護微生物的細胞膜，降低酚、醛、對羥基苯甲酸類等引起的抑菌作用。張光華等[16]曾報道，3%吐溫80 和0.3%蛋黃卵磷脂聯(lián)用降低化學(xué)藥品的抑菌性，但蛋黃卵磷脂較難溶解。本研究選用較易溶解的大豆卵磷脂，添加4%聚山梨酯80 和0.5%大豆卵磷脂作為中和劑，同樣能有效降低供試液中藥材對試驗菌的抑制作用。在進行霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)檢查方法適用性試驗中，添加中和劑能有效增加樣品的溶解性，改善樣品的薄膜堵塞情況，提高薄膜過濾的工作效率。因此，開展對有抑菌作用中藥液體制劑微生物限度檢驗方法的適用性驗證是非常必要的，選用適當?shù)闹泻蛣┠苎杆俪悠芬志?，提高方法適用性試驗準確度，提高檢驗效率。

在建立藥品微生物限度檢查法的過程中，在確保檢驗方法操作簡便快捷的同時，還需充分了解其受微生物限度標準的限制。本品根據(jù)《中國藥典》2020 年版[10]的規(guī)定，霉菌和酵母菌總數(shù)限度標準為101cfu，本品若采用1 ∶10 供試液1 ml 進行檢驗，可能影響結(jié)果有效性的判斷。因此對本品霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)檢查方法適用性研究中，主要采用原液1 ml 和1 ∶10 供試液10 ml 薄膜過濾法進行驗證。考慮到本品自身的抑菌性（白色念珠菌是一種敏感菌株），本驗證采用中和法和薄膜過濾法相結(jié)合進行測定，各試驗菌的回收率與我國藥典規(guī)定一致，方法可行。

本研究是根據(jù)《中國藥典》2020 年版[10]四部通則中規(guī)定的微生物限度檢查法進行檢查，該方法能有效去除藥物自身的抑菌性，簡便易行，確保微生物限度檢查法科學(xué)準確，為藥品常規(guī)監(jiān)管檢驗工作提供技術(shù)支撐。同時，本研究試驗過程和思路可為其他相似的中藥制劑建立微生物限度檢查方法提供參考。