徐利飛 陸素琴 李 慧 董秋平

南京中醫(yī)藥大學鎮(zhèn)江附屬醫(yī)院 鎮(zhèn)江市中醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江 212000

偏頭痛是以反復發(fā)作的單側搏動性頭痛為主要臨床表現(xiàn)，常合并有惡心嘔吐、畏聲光電刺激等伴隨癥狀[1]。偏頭痛常見于青春期起病，女性居多，發(fā)病年齡在35 ～39 歲達到高峰[2]。近年來偏頭痛呈逐年增高的趨勢，有研究顯示[3]，約50%的患者長期受偏頭痛困擾，患者正常生活和工作效率發(fā)生改變，而30%的患者頭痛發(fā)作時根本無法生活和工作。目前西醫(yī)治療偏頭痛以藥物緩解疼痛癥狀為主，長期使用療效不佳，易造成藥物過度性偏頭痛。中醫(yī)藥治療偏頭痛歷史悠久，長期的臨床實踐以及臨床試驗研究肯定了中醫(yī)藥的療效和安全性[4]。

桂芍葛芎湯是由鎮(zhèn)江市名中醫(yī)陸素琴教授在經(jīng)典名方桂枝加葛根湯的基礎上化裁而成，臨床上常用于血瘀寒凝型偏頭痛的治療，并取得滿意療效。鑒于該組方藥物多、活性成分復雜，本研究通過網(wǎng)絡藥理學對桂芍葛芎湯治療偏頭痛的“藥物活性成分-潛在靶標-作用通路”進行預測性分析，并將靶點基因進行分子對接驗證，旨在為桂芍葛芎湯治療偏頭痛的深入研究提供科學的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 桂芍葛芎湯活性成分靶點和偏頭痛靶點篩選

通過TCMSP 對桂芍葛芎湯進行活性成分檢索篩選。篩選條件設置為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18。利用GeneCards、GEO、DisGenet 以及OMIM 數(shù)據(jù)庫，篩選條件：檢索詞設置為“migraine”進行靶點檢索，獲取偏頭痛的相關疾病靶點。

1.2 桂芍葛芎湯治療偏頭痛靶點篩選

將所得到的藥物靶點與疾病靶點分別輸入Venny 2.1 軟件，并制作韋恩圖，得到桂芍葛芎湯和偏頭痛的共有靶點。

1.3 蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡構建及關鍵靶點篩選

將藥物和疾病的共有靶點輸入數(shù)據(jù)庫（STRING）進行PPI 網(wǎng)絡的構建，制作PPI 的網(wǎng)絡圖譜。將STRING 數(shù)據(jù)庫獲得的TSV 文件導入到CytoScape 3.7.2 軟件，將得到的PPI 網(wǎng)絡進行分析，進而篩選出化合物作用于疾病的關鍵靶基因。

1.4 中藥-化合物-靶點網(wǎng)絡構建

為了解中藥、化合物和相應靶點之間作用關系，構建中藥- 化合物- 靶點- 通路- 疾病網(wǎng)絡圖，并導入CytoScape 3.7.2 軟件中進行網(wǎng)絡圖的制作。

1.5 交互靶點基因本體（gene ontology，GO）和京都基因組與基因組百科全書通路（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析

將藥物與疾病共有靶點導入DAVID Bioinformatics Resources 6.8 進行GO 和KEGG 通路富集分析，富集條件為默認原始設置，靶點KEGG 通路富集分析，以P＜ 0.05 有統(tǒng)計學意義標準進行篩選。

1.6 分子對接

將桂芍葛芎湯各藥物的核心靶點與關鍵活性成分進行分子對接，驗證兩者的結合能力，采用Discovery Studio 軟件對Docking Score 絕對值≥5的對接分子構建3D 模型。

2 結果

2.1 桂芍葛芎湯成分靶點和偏頭痛靶點篩選結果

通過對桂芍葛芎湯成分靶點篩選，共得到中藥活性成分共104 個。利用PubChem 數(shù)據(jù)庫對104個活性成分分別進行檢索，篩選得到藥物靶點958個。通過對偏頭痛靶點篩選，對檢索到的疾病相關靶點進行合并、去重，得到疾病靶點3736 個。

2.2 桂芍葛芎湯治療偏頭痛靶點韋恩圖繪制

對篩選出的疾病靶點與藥物靶點進行韋恩圖的繪制，得到416 個共有靶點，見圖1。

圖1 化合物-疾病共有靶點可視化

2.3 PPI網(wǎng)絡構建及關鍵靶點篩選結果

藥物和疾病共有靶點繪制的PPI 網(wǎng)絡圖，其中416 個節(jié)點，6492 條邊，平均度值為31.2。將PPI 網(wǎng)絡拓撲分析，依據(jù)Degree 值排名篩選出桂芍葛芎湯作用于疾病的關鍵靶基因。見圖2 ～3、表1。

表1 關鍵靶點篩選結果

圖2 中藥-疾病共有靶點網(wǎng)絡圖

圖3 中藥-疾病共有靶點PPI 網(wǎng)絡圖

2.4 中藥-化合物-靶點網(wǎng)絡構建

以中藥、化合物和作用靶點為基礎，構建了中藥- 化合物- 靶點- 通路- 疾病網(wǎng)絡圖。見圖4。

圖4 中藥-成分-靶點網(wǎng)絡

2.5 靶點的功能及通路分析

2.5.1 GO 富集功能分析 GO 富集功能分析共有924個條目。其中包括細胞成分（cellular component，CC）142 個，生物學過程（biological processes，BP）1053個，分子功能（molecular function，MF）252 個。運用微生信對排名前十的富集條目進行可視化分析，見圖5。其中橫坐標表示靶點數(shù)，P值越大則越偏向藍色，左側表示BP、CC、MF，P值越小顏色越偏向紅色。

圖5 交互靶點GO 功能富集分析

2.5.2 KEGG 富集功能分析 KEGG 富集功能分析共有180 條信號通路。運用微生信對排名前十的富集條目進行可視化分析。主要與神經(jīng)活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、鈣信號通路、環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號通路、癌癥的途徑、前列腺癌、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、卡波西肉瘤相關的皰疹病毒感染、內分泌抵抗、乙型肝炎、人巨細胞病毒感染、胰腺癌、氮代謝、膀胱癌、化學致癌作用-受體激活、脂質和動脈粥樣硬化、Rap1 信號通路、FoxO 信號通路、急性髓系白血病等過程相關，見圖6，其中橫坐標表示基因的數(shù)量，左側表示各通路名稱，顏色表示P值，P值越小越偏向紅色，P值越大則越偏向綠色。

圖6 KEGG 通路富集分析結果

2.6 分子對接

為檢驗關鍵靶點結構和關鍵活性成分結構的穩(wěn)定性，進行分子對接驗證。兩者結合能力的強弱用Affinity 值表示，配體和受體的結合越穩(wěn)定，則結合能力越低。表2 和圖7 ～8 顯示了核心靶點的結合能力及ALB 的結合模式。

表2 關鍵靶點結合能力（kcal/mol）

圖8 基于分子對接ALB 和formononetin 的結合模式

3 討論

中醫(yī)關于偏頭痛早有記載，《內徑》稱之為“頭風”“腦風”等，中醫(yī)認為偏頭痛病因不外乎內感和外傷兩大類。頭為“精明之府”“諸陽之會”，外邪可以直接侵襲頭部，經(jīng)脈痹阻而發(fā)為頭痛；內傷久病，正氣虛衰，腦脈失于濡養(yǎng)，則不榮則痛。本病中醫(yī)治療原則以溫經(jīng)散寒，活血化瘀為大法。相比西醫(yī)治療而言，中醫(yī)療法能明顯減少頭痛發(fā)作頻次，顯著改善頭痛程度，具有安全性高，副作用小的優(yōu)勢[5]。桂芍葛芎湯是在經(jīng)典名方桂枝加葛根湯的基礎上加減配伍而成，臨床療效頗豐，現(xiàn)將該組方治療偏頭痛可能的作用機制進行網(wǎng)絡藥理學分析，研究結果如下。

通過本研究得到桂芍葛芎湯藥物靶點958 個，涉及活性成分共104 個。偏頭痛靶點3736 個，桂芍葛芎湯治療偏頭痛的潛在作用靶點416 個。在桂芍葛芎湯諸多活性成分中，花旗松素、β-谷甾醇、谷甾醇、兒茶酚、過氧麥角甾醇等活性成分在治療偏頭痛的過程中發(fā)揮了重要作用。花旗松素（toxifolin）又名二氫槲皮素、紫葉杉素，是一種天然抗氧化劑，被稱為“清基之王”，具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎等多種藥理活性[6]。研究表明，花旗松素可降低血液的黏稠度，改善毛細血管微循環(huán)，從而達到改善頭痛的作用[7]。β-谷甾醇具有顯著的抗氧化性、抗炎性，可使細胞中白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8、IL-1β 等因子減少，進而減輕頭痛的炎癥反應[8]。

通過相關靶點PPI 網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)，桂芍葛芎湯治療偏頭痛排名前五的核心靶點基因包括白蛋白（albumin，ALB），腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF），IL-6，蘇氨酸蛋白激酶（threonine protein kinase，AKT1），甘油醛-3- 磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）。炎細胞因子TNF、IL-6 參與偏頭痛的病理生理學過程，并且與中樞神經(jīng)系統(tǒng)痛覺關系緊密[9-10]。有研究表明，由于頭痛患者體內細胞免疫應答吞噬和殺傷能力降低，引起體內細菌脂多糖增加，進而誘導TNF 和IL-6 的釋放過量，引發(fā)神經(jīng)源性炎癥，參與神經(jīng)源性疼痛[11]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)1 存在于人外周血單核細胞中，為評價炎癥的重要指標之一，與炎癥密切相關，通常是炎癥各種通路的一份子[12]。由此表明，通過相關靶點PPI 網(wǎng)絡分析可以看出桂芍葛芎湯治療偏頭痛具有多靶點特點。

通過對桂芍葛芎湯治療偏頭痛的通路富集分析可以得出，在諸多通路中，癌通路是其中復雜且重要的通路之一，包含了IL-6、核因子（nuclear factor，NF）-κB、MAPK 和PI3K/AKT 等通路。有研究顯示，通過激活PI3K/AKT 通路可以提高神經(jīng)保護功能，從而抑制氧化應激神經(jīng)元的自噬[13]。神經(jīng)源性炎癥反應是偏頭痛發(fā)病的重要病理環(huán)節(jié)，而抑制NF-κB 和MAPK 通路的激活可減輕神經(jīng)源性炎癥的發(fā)生[14-15]。本研究進一步從分子對接的角度闡述蛋白和配體的結合活性，選取了ALB 和IL-6 的兩個關鍵靶點，結果表明，桂芍葛芎湯的主要活性成分與關鍵疾病靶點均具有良好的對接活性，進一步證實了桂芍葛芎湯的有效成分可通過調控ALB、TNF、IL-6、AKT1 等核心靶點基因，通過上述各富集信號通路發(fā)揮治療偏頭痛的作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡藥理學及分子對接的研究方法對桂芍葛芎湯治療偏頭痛的潛在作用機制進行了預測分析，在一定程度上揭示了桂芍葛芎湯可通過多成分、多通路、多靶點防治偏頭痛，為桂芍葛芎湯的推廣應用提供了理論及基礎依據(jù)。本研究存在一定的局限性，研究結論僅局限于數(shù)據(jù)庫和相關文獻，在今后的臨床和實驗研究工作中需進一步對篩選的關鍵靶點及相關通路加以驗證。