袁相鳳 羅增香 李建娜 孫麗娜

濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科，山東濰坊 261013

白癜風(fēng)是一種常見(jiàn)的色素脫失性皮膚病，發(fā)病率占全球人口的0.5%～2.0%[1]。該疾病的特征是黑色素細(xì)胞丟失，導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)典型的非杯狀白色斑點(diǎn)。近年來(lái)，研究者對(duì)白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)取得了較大進(jìn)展，目前已明確將白癜風(fēng)歸類(lèi)為自身免疫性疾病。白癜風(fēng)不僅影響患者容貌外觀，而且會(huì)給患者心理上造成沉重的壓力，在日常生活導(dǎo)致諸多不便[2]。黑素皮質(zhì)受體（melanocortin receptors，MCRs）參與了包括色素沉積、攝食、能量代謝、抗感染等各環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了5 個(gè)MCRs家族成員：MC1R ～MC5R，其中黑素皮質(zhì)受體1（melanocortin 1 receptor，MC1R）蛋白參與黑色素的生物學(xué)反應(yīng)，影響黑色素細(xì)胞的產(chǎn)生。MC1R 活性降低會(huì)導(dǎo)致頭發(fā)變紅、膚色變淺。另有研究指出，MC1R 活性降低與雀斑、皮膚癌的發(fā)生也有關(guān)[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)在白癜風(fēng)患者皮膚組織中MC1R 基因表達(dá)下調(diào)，提示MC1R 可能是與白癜風(fēng)相關(guān)的基因[6]。目前MC1R 在白癜風(fēng)黑色素細(xì)胞中調(diào)控作用的相關(guān)研究報(bào)道罕見(jiàn)。因此，本研究探討MCIR 在白癜風(fēng)黑色素細(xì)胞中的作用和機(jī)制，旨在闡明白癜風(fēng)發(fā)生機(jī)制，為臨床診治靶點(diǎn)選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正常人表皮黑色素細(xì)胞系PIG1 和白癜風(fēng)黑色素細(xì)胞系PIG3V 購(gòu)自上海中科院。Trizol 試劑盒和細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒（美國(guó)Invitrogen 公司），Western Blot 一抗（美國(guó)ABCam 公司），Western Blot 酶標(biāo)二抗和活性氧（reactive oxygen species，ROS）試劑盒（南京建成生物研究所），真核表達(dá)載體和siRNA（上海吉瑪公司），MTT 試劑盒（德國(guó)Thermo 公司），凋亡試劑盒（美國(guó)BD 公司）。

1.2 方法

1.2.1 MC1R 真核表達(dá)載體和siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞 PIG1細(xì)胞用于構(gòu)建MC1R 敲減細(xì)胞模型，隨機(jī)分為MC1R siRNA 組、siRNA 陰性對(duì)照（negative control，NC）組和空白對(duì)照（PIG1）組；PIG3V 細(xì)胞用于構(gòu)建MC1R過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型，隨機(jī)分為過(guò)表達(dá)（overexpression，oe）-MC1R 組、MC1R NC 組和空白對(duì)照（PIG3V）組。將5 μl MC1R siRNA/siRNA NC、pcDNA-MC1R/pcDNA NC 與245 μl Opti-MEMTM減血清培養(yǎng)基混勻；將5 μl 轉(zhuǎn)染液和245 μl Opti-MEM 混勻；再將以上兩種混合液混合，室溫放置30 min；緩慢將上述混合液逐滴滴加到相應(yīng)組別的6 孔板孔中，混勻，37℃培養(yǎng)6 h，更換成完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2 Western Blot RIPA 蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，定量檢測(cè)蛋白濃度后，電泳分離，轉(zhuǎn)膜后封閉，含5%脫脂奶粉的1×TBST 緩沖液按1 ∶100稀釋一抗，4℃過(guò)夜。用1×TBST 緩沖液洗膜后，加入二抗，室溫下孵育60 min，用1×TBST 緩沖液洗膜3 次。ECL 試劑顯色，并成像。

1.2.3 MTT 檢測(cè) 將各組細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為105/ml，按100 μl/孔加入96 孔板，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，共接種6 塊96 孔板，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。在接種后的第0、6、12、24、48、72 小時(shí)，分別取出1 塊96孔板，向各孔加入10 μl MTT 檢測(cè)試劑，將96 孔板放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制反映細(xì)胞生長(zhǎng)情況的增殖曲線。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)周期和凋亡 將各組細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，調(diào)整為105/ml 的細(xì)胞懸液。向流式細(xì)胞管中先加入20 μl 膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰基熒光素（FITC），再加入100 μl 各組細(xì)胞，混勻后室溫遮光孵育15 min，再各加入20 μl 碘化丙啶（propidine iodide，PI），混勻后室溫避光孵育10 min。設(shè)置僅加20 μl Annexin V-FITC 或僅加20 μl PI 的兩支單陽(yáng)管和不加任何試劑的陰性對(duì)照管。各管加入1 ml PBS 緩沖液，混勻，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè) 將各組細(xì)胞用胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù)，鋪6 孔板培養(yǎng)過(guò)夜。向6 孔板各孔加入1 ml 不完全DMEM 培養(yǎng)液按1 ∶1000 稀釋的2，7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）探針，繼續(xù)培養(yǎng)60 min。將細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用SNK-q 檢驗(yàn)，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 調(diào)控MC1R表達(dá)對(duì)黑色素細(xì)胞增殖的影響

MC1R siRNA 組細(xì)胞MC1R mRNA 和蛋白表達(dá)降低（P＜ 0.05），顯著抑制細(xì)胞增殖（P＜ 0.05）；oe-MC1R 組細(xì)胞MC1R mRNA 和蛋白表達(dá)增高（P＜ 0.05），促進(jìn)細(xì)胞增殖（P＜ 0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 調(diào)控MC1R 表達(dá)對(duì)黑色素細(xì)胞增殖的影響

2.2 調(diào)控MC1R表達(dá)對(duì)黑色素細(xì)胞周期和凋亡的影響

MC1R siRNA 組下調(diào)MC1R 表達(dá)后導(dǎo)致黑色素細(xì)胞凋亡率增加（P＜ 0.05），G2/M 期細(xì)胞所占比例升高（P＜ 0.05）；oe-MC1R 組細(xì)胞過(guò)表達(dá)MC1R 后抑制黑色素細(xì)胞凋亡，G2/M 期細(xì)胞所占比例降低（P＜ 0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 調(diào)控MC1R 表達(dá)對(duì)黑色素細(xì)胞周期和凋亡的影響

2.3 調(diào)控MC1R表達(dá)對(duì)黑色素細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響

MC1R siRNA 組細(xì)胞下調(diào)MC1R 表達(dá)后ROS水平顯著增加（P＜ 0.05），oe-MC1R 組細(xì)胞過(guò)表達(dá)MC1R 后ROS 水平顯著降低（P＜ 0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 調(diào)控MC1R 表達(dá)對(duì)黑色素細(xì)胞ROS 產(chǎn)生的影響

2.4 調(diào)控MC1R表達(dá)對(duì)黑色素細(xì)胞促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase phosphatases，MAPK）通路、凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)影響

MC1R siRNA 組細(xì)胞下調(diào)MC1R 表達(dá)后Bcl-2、Cyclin D1 蛋白水平降低（P＜ 0.05），p-p38 MAPK、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、Caspase 3、Bax、p53 和p21 蛋白水平升高（P＜ 0.05）。oe-MC1R組細(xì)胞過(guò)表達(dá)MC1R 后Bcl-2、Cyclin D1 蛋白水平升高（P＜ 0.05），p-p38 MAPK、JNK、Caspase 3、Bax、p53 和p21 蛋白水平降低（P＜ 0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 調(diào)控MC1R 表達(dá)對(duì)黑色素細(xì)胞MAPK 通路、凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)影響

3 討論

MC1R 是黑色素生成和色素沉著的調(diào)節(jié)劑之一。研究表明，白癜風(fēng)患者非病變皮膚中MC1R 的表達(dá)減少，而上調(diào)MC1R 表達(dá)可能通過(guò)負(fù)反饋機(jī)制恢復(fù)病變皮膚中的正常色素沉著[7-8]。但是否可以通過(guò)調(diào)控MC1R 表達(dá)從而改變黑色素細(xì)胞生物學(xué)行為尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)人為干預(yù)細(xì)胞中的MC1R 表達(dá)水平，使人正常黑色素細(xì)胞低表達(dá)MC1R，而白癜風(fēng)黑色素細(xì)胞高表達(dá)MC1R，從而進(jìn)一步觀察各組細(xì)胞生物行為變化，并對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行初步研究。

本研究結(jié)果顯示，MC1R siRNA 組MC1R 表達(dá)減少后，黑色素細(xì)胞增殖速度明顯減慢，而轉(zhuǎn)入過(guò)表達(dá)載體的oe-MC1R 組，MC1R 表達(dá)顯著增加可以加速白癜風(fēng)黑色素細(xì)胞的增殖速度，該結(jié)果提示過(guò)表達(dá)MC1R 對(duì)黑色素細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用。既往研究提示在白癜風(fēng)病變過(guò)程中，由于黑色素細(xì)胞數(shù)量減少，導(dǎo)致患者病情加重，而在其病變組織中MC1R 表達(dá)水平明顯降低，MC1R 表達(dá)降低可抑制黑色素細(xì)胞增殖，病變組織不能及時(shí)補(bǔ)充黑色素細(xì)胞，因此無(wú)法代償患者的病變損傷[9]。本研究表明可以通過(guò)上調(diào)MC1R 的表達(dá)，促進(jìn)黑色素細(xì)胞增殖，有利于白癜風(fēng)病變組織補(bǔ)充黑色素細(xì)胞，從而輔助白癜風(fēng)治療。

白癜風(fēng)病變組織中黑色素細(xì)胞數(shù)量減少除了和增殖減慢無(wú)法代償病損之外，同時(shí)也和黑色素細(xì)胞破壞增多密切相關(guān)，研究證實(shí)G2/M 期阻滯能誘導(dǎo)黑色素細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致黑色素細(xì)胞破壞增多，加重了黑色素細(xì)胞減少[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在黑色素細(xì)胞中敲減MC1R 的表達(dá)，可以導(dǎo)致黑色素細(xì)胞凋亡率增高，G2/M 期細(xì)胞所占比例升高；而在白癜風(fēng)黑色素細(xì)胞中上調(diào)MC1R 表達(dá)，可降低白癜風(fēng)黑色素細(xì)胞的凋亡率，G2/M 期所占比例降低，結(jié)果證實(shí)MC1R 表達(dá)下調(diào)能引起黑色素細(xì)胞的G2/M期阻滯，促進(jìn)黑色素細(xì)胞凋亡，這可能是導(dǎo)致白癜風(fēng)病情進(jìn)展的重要因素之一。

既往研究表明[12-16]，病理情況下，ROS 過(guò)度累積可以直接或間接損傷DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子，誘導(dǎo)細(xì)胞啟動(dòng)凋亡程序，引起皮膚黑色素細(xì)胞破壞和丟失，是白癜風(fēng)發(fā)病的重要機(jī)制之一。本研究顯示，在黑色素細(xì)胞中敲減MC1R 的表達(dá)，導(dǎo)致ROS 水平升高；反之，在白癜風(fēng)黑色素細(xì)胞上調(diào)MC1R 表達(dá)，可引起ROS 水平降低，該結(jié)果提示高表達(dá)MC1R 能減輕白癜風(fēng)黑色素細(xì)胞中ROS 損傷發(fā)生，促進(jìn)黑色素細(xì)胞中的氧化-抗氧化系統(tǒng)平衡，保護(hù)細(xì)胞不受氧化應(yīng)激損傷。

MAPK 通路是真核細(xì)胞中一個(gè)經(jīng)典的信號(hào)通路，可以參與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期過(guò)程。MAPK 通路中p-p38 MAPK 能促進(jìn)p53 磷酸化，磷酸化抗凋亡蛋白Bcl-2 家族相關(guān)成員，促進(jìn)線粒體細(xì)胞色素釋放，激活Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活凋亡蛋白Caspase 3，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞受損時(shí)，p53 能激活p21 轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞周期停滯在G2 期，對(duì)于無(wú)法完成修復(fù)的細(xì)胞，將誘導(dǎo)啟動(dòng)凋亡程序，細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1 能促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展[17-20]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，敲減MC1R 在正常人黑色素細(xì)胞的表達(dá)，Bcl-2、Cyclin D1 蛋白水平降低，p-p38 MAPK、JNK、Caspase 3、Bax、p53 和p21 蛋白水平升高。而上調(diào)MC1R 在癜風(fēng)黑色素細(xì)胞表達(dá)，則逆轉(zhuǎn)上述蛋白表達(dá)水平。

本研究結(jié)果證實(shí)了高表達(dá)MC1R 能夠調(diào)控MAPK 途徑以及抑制ROS 產(chǎn)生，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞凋亡蛋白家族和細(xì)胞周期相關(guān)因子，從而抑制黑色素細(xì)胞凋亡，上調(diào)G2/M 期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。本研究在既往研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步深入研究，探討了MC1R在黑色素細(xì)胞增殖和凋亡中的作用和相關(guān)調(diào)控機(jī)制，并證實(shí)了MC1R 可以作為白癜風(fēng)黑色素細(xì)胞中的關(guān)鍵調(diào)控因子。但本研究存在一定局限性，目前僅停留在細(xì)胞水平上，未在動(dòng)物水平進(jìn)一步證實(shí)，在下一步研究中擬建立白癜風(fēng)動(dòng)物模型，分析調(diào)控MC1R 表達(dá)對(duì)白癜風(fēng)的治療作用和相關(guān)機(jī)制，從而為臨床白癜風(fēng)新靶點(diǎn)確定提供參考。

綜上所述，MC1R 可能通過(guò)調(diào)控MAPK 途徑和ROS 生成，調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)因子，引起黑色素細(xì)胞生物學(xué)行為改變，參與白癜風(fēng)黑色素細(xì)胞的病變過(guò)程。