孫 巖 葉冬霞 楊 薇

吉林省肝膽病醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，吉林長春 130062

肝癌是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率居惡性腫瘤第5 位[1-2]，主要以肝細(xì)胞癌為主。我國每年約34.4 萬患者死于肝癌，占世界肝癌病死患者的55%[3-4]。肝細(xì)胞癌具有發(fā)病隱匿、進(jìn)展快、易轉(zhuǎn)移和惡性程度高的特點(diǎn)，大多數(shù)患者在首次確診時(shí)已是晚期，無法通過手術(shù)切除，預(yù)后較差[5-6]。ATP 檸檬酸裂解酶（adenosine triphosphate citrate lyase，ACLY）將檸檬酸以及輔酶A 轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A 和草酰乙酸，是脂肪酸代謝通路最上游的關(guān)鍵酶[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)在肺癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌以及結(jié)腸癌等腫瘤中，ACLY 表達(dá)上調(diào)或激活[9]，靶向抑制ACLY 成為一個(gè)潛在的研究熱點(diǎn)。本研究應(yīng)用多種數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘分析，探討ACLY 在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)差異和臨床意義。

1 材料與方法

1.1 UALCAN數(shù)據(jù)庫挖掘方法

使用UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/）數(shù)據(jù)庫檢索分析ACLY mRNA 在肝癌組織和正常肝組織中表達(dá)及ACLY 基因表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者臨床病理指標(biāo)和生存期的相關(guān)性。

1.2 GEPIA數(shù)據(jù)庫挖掘方法

使用GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html）數(shù)據(jù)庫分析ACLY 在肝癌組織與正常肝組織中的表達(dá)及ACLY 表達(dá)對(duì)肝細(xì)胞癌患者總生存期和無病生存期的影響。

1.3 HPA數(shù)據(jù)庫

使用HPA（http://www.Proteinatlas.org/）數(shù)據(jù)庫分析正常肝組織和肝癌組織中ACLY 蛋白表達(dá)水平，Kaplan-Meier 生存分析評(píng)估患者的預(yù)后。

1.4 STRING數(shù)據(jù)庫

使用STRING（http://string-db.org）數(shù)據(jù)庫分析ACLY 共表達(dá)基因所調(diào)控的蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

GEPIA 數(shù)據(jù)庫中，以log2（fold change）顯示ACLY 基因在癌組織和正常肝組織中的表達(dá)差異；通過單因素方差分析ACLY 基因表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。Kaplan-Meier 法分析ACLY 表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者生存期的相關(guān)性，并進(jìn)行l(wèi)og-rank 檢驗(yàn)，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ACLY在肝癌組織中的表達(dá)

本研究首先采用UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析ACLY mRNA 在肝癌和正常肝組織的表達(dá)水平，其中正常肝組織50 例和肝癌組織371 例，肝癌組織中ACLY mRNA 表達(dá)量明顯高于正常肝組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖1。GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析160 例正常肝組織和369 例肝癌組織中ACLY mRNA 表達(dá)量的中位數(shù)分別為3.12 和4.75 TPM，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖2。采用HPA 數(shù)據(jù)庫分析ACLY 蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示肝癌組織中ACLY蛋白表達(dá)水平明顯高于正常肝組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖3。

圖1 UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析ACLY mRNA 在正常肝組織和癌組織中表達(dá)

圖2 GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析ACLY mRNA 在正常肝組織和肝癌組織中表達(dá)

圖3 ACLY 蛋白在正常肝組織和肝癌組織中表達(dá)（200×）

2.2 ACLY表達(dá)與肝細(xì)胞癌臨床病理特征的相關(guān)性

HPA 數(shù)據(jù)庫分析ACLY 表達(dá)與肝細(xì)胞癌臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果顯示，正常肝組織、stage1、stage2、stage3、stage4 ACLY 表達(dá)量中位數(shù)分別為9.953、27.306、26.551、32.410 和27.876 TPM，正常肝組織與不同肝癌分期的ACLY 表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖4；病理分級(jí)中，正常肝組織、Grade1、Grade2、Grade3、Grade4 級(jí)ACLY 表達(dá)量的中位數(shù)分別為9.953、23.765、25.903、30.534、36.619 TPM，正常肝組織與不同腫瘤分期的ACLY 表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖5；在不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期（N 分期）中，正常肝組織與N0、N1 期的ACLY 表達(dá)量中位數(shù)分別為9.953、30.239 和53.341 TPM，正常肝組織與N0 分期亞組的ACLY表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），與N1 分期亞組的表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），見圖6。

圖4 ACLY 的表達(dá)與臨床分期的相關(guān)性

圖5 ACLY 的表達(dá)與病理分級(jí)的相關(guān)性

圖6 ACLY 的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

2.3 ACLY的表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者生存率的相關(guān)性

UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析ACLY 的表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者生存率的相關(guān)性，結(jié)果顯示，與ACLY 低或中表達(dá)（n=274）比較，ACLY 高表達(dá)（n=91）肝細(xì)胞癌患者生存率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖7。GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，ACLY 高表達(dá)組患者（n=182）總生存率明顯低于ACLY 低表達(dá)組（n=182），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（log-rankP=0.011，HR=1.6），見圖8。HPA 數(shù)據(jù)庫分析顯示，ACLY 高表達(dá)組患者5 年生存率為42%，明顯低于低表達(dá)組的52%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖9。Kaplan-Meier 生存分析結(jié)果進(jìn)一步佐證UALCAN和GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果，見圖10。

圖7 ACLY 的表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者生存率的相關(guān)性

圖8 ACLY 的表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者生存率的相關(guān)性

圖9 ACLY 表達(dá)對(duì)肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的影響

圖10 HPA 數(shù)據(jù)庫Kaplan-Meier 生存分析圖

2.4 與ACLY相關(guān)蛋白分析

利用STRING 數(shù)據(jù)庫分析與ACLY 密切關(guān)聯(lián)的基因PPI 網(wǎng)絡(luò)，得到一個(gè)包含11 個(gè)節(jié)點(diǎn)，40 種相互作用的PPI 網(wǎng)絡(luò)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），ACLY 及其相互作用蛋白質(zhì)主要參與調(diào)控脂肪酸、脂質(zhì)和膽固醇代謝。見圖11。

圖11 STRING 在線分析以ACLY 為中心的PPI 網(wǎng)絡(luò)

3 討論

代謝重編程通過調(diào)節(jié)能量代謝促進(jìn)細(xì)胞快速生長和增殖，是惡性腫瘤的標(biāo)志。代謝重編程改變腫瘤細(xì)胞物質(zhì)和能量代謝方式，為腫瘤細(xì)胞生長、分裂提供ATP 和核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，對(duì)腫瘤細(xì)胞快速進(jìn)展至關(guān)重要[10-11]。腫瘤細(xì)胞通過脂代謝的重編程滿足腫瘤細(xì)胞快速增殖對(duì)磷脂、糖脂以及膽固醇等脂類的需求。腫瘤細(xì)胞中超過90%的脂肪酸來源于重頭合成途經(jīng)[12]。ACLY 是由4 個(gè)亞基組成胞質(zhì)酶，催化檸檬酸鹽生成乙酰輔酶A（acetyl coenzyme A，acetyl-CoA），acetyl-CoA 是細(xì)胞內(nèi)脂肪酸和膽固醇合成的重要材料[13]。ACLY 在膀胱癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肺癌中表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，通過抑制ACLY 可以阻斷絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/ 蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信號(hào)通路，從而抑制癌細(xì)胞的生長和增殖[14]。本研究利用UALCAN、GEPIA 和HPA 數(shù)據(jù)庫在線分析結(jié)果顯示，ACLY 在肝癌組織中表達(dá)顯著高于正常肝組織，與其他癌癥類型類似。研究報(bào)道，癌組織中ACLY 表達(dá)水平對(duì)腫瘤的臨床分期、病理分級(jí)、療效效果預(yù)測(cè)具有一定指導(dǎo)意義[15-16]。本研究利用數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步挖掘分析ACLY 過表達(dá)在肝細(xì)胞癌預(yù)后中的意義，結(jié)果顯示癌組織ACLY 的高表達(dá)與肝癌臨床分期、病理分級(jí)、不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期具有明顯的相關(guān)性，ACLY 的高表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者總生存率有關(guān)，肝癌組織ACLY 高表達(dá)的肝細(xì)胞癌患者生存率低。本研究通過UALCAN、GEPIA和HPA 數(shù)據(jù)庫挖掘分析發(fā)現(xiàn)ACLY 影響肝細(xì)胞癌患者疾病進(jìn)展，ACLY 表達(dá)水平與患者預(yù)后生存時(shí)間具有顯著的相關(guān)性，可以作為肝細(xì)胞癌生存預(yù)后的一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)指標(biāo)，具體機(jī)制需要進(jìn)一步收集臨床數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)研究論證。

綜上所述，本研究通過多個(gè)數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果表明癌組織中ACLY 表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后具有一定相關(guān)性，是否可以將ACLY 可作為生物標(biāo)志物評(píng)估肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后，有待于通過臨床觀察予以證實(shí)。通過逆轉(zhuǎn)脂肪酸代謝重編程，進(jìn)而控制肝細(xì)胞癌的進(jìn)展，可能是今后肝細(xì)胞癌的有效治療策略。