李 彬，汪 越，侯鳳偉，杜家如，童旭輝

蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院/安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心，安徽 蚌埠233030

睪丸癌是青年人群中最常見的惡性腫瘤［1］。西方國(guó)家發(fā)病率在過去20年中上升,手術(shù)和以順鉑為基礎(chǔ)的化學(xué)療法的結(jié)合使得睪丸癌患者的治愈率大于90%［2］。盡管如此，10%～20%患有轉(zhuǎn)移性疾病的睪丸癌患者不能通過基于順鉑的化療治愈［3］。因此，探索治療睪丸腫瘤的新方法具有研究?jī)r(jià)值。

鐵死亡是一種鐵依賴形式的非凋亡細(xì)胞死亡，其特征是脂質(zhì)ROS的積累［4］。在細(xì)胞和小鼠中進(jìn)行的遺傳學(xué)研究確定硒酶谷胱甘肽過氧化物酶（GPX4）是這種形式的細(xì)胞死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。GPX4將脂質(zhì)氫過氧化物轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)醇，這一過程阻止了鐵（Fe2+）依賴的有毒脂質(zhì)活性氧（ROS）的形成。GPX4功能的抑制導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，并可誘導(dǎo)鐵死亡［5,6］。近年來，人們?cè)谠O(shè)計(jì)和開發(fā)基于鐵死亡誘導(dǎo)的抗癌藥物方面做了大量工作，在癌癥治療中引入鐵死亡具有很好的治療潛力［7］。RSL3是一種常用的鐵死亡誘導(dǎo)劑，通過抑制谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）造成細(xì)胞脂質(zhì)過氧化物堆積導(dǎo)致鐵死亡［8］。在晚期前列腺癌、肝癌以及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，RSL3可以通過誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生發(fā)揮較好的腫瘤細(xì)胞殺傷作用［9-11］。然而，RSL3能否在睪丸癌細(xì)胞I-10中觸發(fā)鐵死亡尚未見報(bào)道。

大多數(shù)睪丸腫瘤的特征是PTEN的缺失，PTEN是一種負(fù)性調(diào)節(jié)PI3K信號(hào)的腫瘤抑制因子，因此睪丸腫瘤中PI3K/AKT/mTOR通路活性異常增強(qiáng)，睪丸腫瘤模型也顯示異常增強(qiáng)的PI3K/AKT/mTOR通路［3］。PTEN功能缺失在人類腫瘤中較為多見，腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)為對(duì)鐵死亡的抵抗性，抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)軸能使癌細(xì)胞對(duì)鐵死亡誘導(dǎo)敏感［12］。有研究發(fā)現(xiàn)mTOR有助于保護(hù)心肌細(xì)胞免受鐵死亡和過量鐵的影響［13］，雷帕霉素衍生物依維莫司聯(lián)合RSL3/Erastin在腎細(xì)胞癌中表現(xiàn)出協(xié)同作用，促進(jìn)鐵死亡［14］。以上研究提示，靶向mTOR結(jié)合誘發(fā)鐵死亡對(duì)于睪丸癌的治療具有一定的臨床意義。雷帕霉素是雷帕霉素復(fù)合物1（mTORC1）機(jī)制靶點(diǎn)的抑制劑，其通過結(jié)合FKBP12發(fā)揮抑制mTORC1的作用［15,16］。因此，雷帕霉素可能通過抑制mTOR促進(jìn)RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡，提高睪丸癌細(xì)胞對(duì)RSL3的敏感性。為此，本文旨在研究雷帕霉素是否提高RSL3對(duì)睪丸癌I-10細(xì)胞的抑制作用，并探討雷帕霉素對(duì)RSL3抗睪丸癌I-10細(xì)胞活性的影響及其作用機(jī)制，為睪丸癌的治療方法提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基（Biosharp）；胎牛血清（杭州四季青）；雷帕霉素（RAPA）（MCE）；RSL3（Type II）（MCE）；谷胱甘肽（GSH）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物有限公司）；丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物有限公司）；GPX4 抗體（Proteintech）；C11 BODIPY 581/591 熒光探針（賽默飛）；GAPDH（Proteintech）；胰酶（Biosharp）、細(xì)胞裂解液（上海碧云天）；其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析級(jí)。

1.2 細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠間質(zhì)瘤細(xì)胞株I-10來源于ATCC（Manassas,VA,USA），細(xì)胞在含5%CO2的37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為RPMI 1640，含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞I-10，以5×104/mL 密度接種于96孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約60%后，更換含藥培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)分為單用RSL3組和與雷帕霉素合用組，RSL3濃度分別為0、1、2、4、8、16 μmol/L，雷帕霉素濃度為16 μmol/L。培養(yǎng)24 h 后，添加5 mg/mL MTT 溶液（10μL/孔），在37 ℃的黑暗條件下孵育4 h。棄去培養(yǎng)液后每孔加入100 μL DMSO置于37 ℃烘箱中孵育30 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)A490值。樣品檢測(cè)全程避光操作。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4 集落克隆形成實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞以500個(gè)/孔接種于六孔板，待細(xì)胞緊貼壁以后，用含藥培養(yǎng)液培養(yǎng)10 d，藥物分組為：Control組、雷帕霉素（16 μmol/L）、RSL3（2 μmol/L）組、雷帕霉素合用RSL3組；顯微鏡下觀察集落數(shù)大于50，棄培養(yǎng)液，用PBS清洗2遍，4%多聚甲醛室溫固定30 min后，再用0.1%結(jié)晶紫室溫染色30 min，并拍照。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞以2×105/孔鋪種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%時(shí)，用200 μL槍頭沿每孔中央劃一條直線，用PBS清洗去除漂浮細(xì)胞，每孔加入2 mL含藥無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，藥物分組為：Control組、雷帕霉素（16 μmol/L）組、RSL3（2 μmol/L）組、雷帕霉素合用RSL3組；分別在培養(yǎng)0 h、24 h用顯微鏡拍照。計(jì)算劃痕愈合率。

1.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

在Transwell上室內(nèi)加入50μL基質(zhì)膠，置于37 ℃恒溫箱中孵育30 min，待膠凝固。收集I-10細(xì)胞，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整為含藥的細(xì)胞懸液（2×105/mL），藥物分組為：Control組、雷帕霉素（16 μmol/L）組、RSL3（2 μmol/L）組、雷帕霉素合用RSL3組；分別取100μL加入上室，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液500μL。每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次；培養(yǎng)48 h 后取出Transwell小室，用PBS清洗兩次，然后用4%多聚甲醛室溫固定30 min，結(jié)晶紫室溫染色30 min。采用光學(xué)倒置顯微鏡（×100）下計(jì)數(shù)侵襲至微孔膜下層的細(xì)胞，每個(gè)樣本觀察3個(gè)視野。

1.7 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)

無需在Transwell 上室內(nèi)鋪基質(zhì)膠，其余步驟同1.6。

1.8 Lipid ROS檢測(cè)

將細(xì)胞以2×105/mL的密度接種于六孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至60%左右，藥物處理24 h。藥物分組為：Control組、RSL3（2 μmol/L）組、雷帕霉素（16 μmol/L）組、雷帕霉素合用RSL3組。24 h后棄去含藥培養(yǎng)基，用PBS清洗兩次，每組加入1 mL含有5 μmol/L的C11 BODIPY 581/591熒光探針的RPMI 1640培養(yǎng)基避光染色。在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min后，用無EDTA的胰酶消化細(xì)胞并收集至10 mL離心管中，1200 r/min離心8 min，再用PBS離心清洗2次。在細(xì)胞沉淀中加入300 μL PBS讓細(xì)胞重懸，轉(zhuǎn)移至流式管中在激發(fā)光為488 nm檢測(cè)氧化態(tài)細(xì)胞數(shù)量，收集數(shù)據(jù)并保存文件，使用Flowjo進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.9 GSH和MDA含量檢測(cè)

使用谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒,按照使用說明檢測(cè)各組細(xì)胞中GSH和MDA含量。

1.10 Western blot檢測(cè)

收集各組細(xì)胞，加適量增強(qiáng)型RIPA，冰上裂解30 min后，于4 ℃以12 000 r/min離心30 min，收集蛋白并定量。配制12%SDS-PAGE凝膠。將定量樣品上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗，一抗于4 ℃孵育過夜，第2天取出以TPBS清洗3次，10 min/次。二抗于室溫孵育2 h，TPBS清洗3次，10 min/次。ECT發(fā)光試劑盒暗室發(fā)光，顯影；Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，ImageJ掃描灰度值定量分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，兩組之間均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，兩組以上均數(shù)比較采用單因素方差分析。統(tǒng)計(jì)圖采用Graphpad Prism 8.0 繪制，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雷帕霉素增強(qiáng)RSL3對(duì)I-10細(xì)胞增殖的抑制作用

觀察RSL3對(duì)睪丸癌I-10細(xì)胞的抑制作用，結(jié)果顯示隨著RSL3給藥濃度的提高，細(xì)胞存活率逐漸下降（圖1A）。在合用雷帕霉素（16 μmol/L）之后，細(xì)胞存活率進(jìn)一步下降（P＜0.01，圖1A）。為減少細(xì)胞活力對(duì)侵襲、遷移的影響，實(shí)驗(yàn)中選用低濃度RSL3（2 μmol/L），后續(xù)實(shí)驗(yàn)包括集落以及鐵死亡相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)也選用同樣濃度的RSL3。通過集落克隆實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單用RSL3組集落形成數(shù)明顯低于Control組（P＜0.05，圖1B）；與單用RSL3組相比，雷帕霉素合用RSL3組集落形成數(shù)進(jìn)一步下降（P＜0.05，圖1B）。

圖1 雷帕霉素增強(qiáng)RSL3對(duì)I-10細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.1 Rapamycin enhances the inhibitory effect of RSL3 on I-10 cell proliferation.A:Cell viability assessed by MTT assay.B:Colony formation assay of I-10 cells at 10 days of culture(n=3,＊＊P＜0.01 vs 2 μmol/L RSL3,####P＜0.0001 vs RSL3,&&&&P＜0.0001 vs RSL3).*P＜0.05,#P＜0.05.

2.2 雷帕霉素增強(qiáng)RSL3對(duì)I-10細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用

I-10細(xì)胞在雷帕霉素（16 μmol/L）、RSL3（2 μmol/L）或雷帕霉素合用RSL3處理后，劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與Control 組相比，RSL3 組劃痕愈合率顯著減?。≒＜0.01，圖2A）、穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05，圖2B）；與單用RSL3組相比，雷帕霉素合用RSL3組劃痕愈合率進(jìn)一步減小（P＜0.001，圖2A）、穿膜細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步減少（P＜0.01，圖2B）。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與Control 組相比，RSL3 組穿膜細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.01，圖2C）；與單用RSL3組相比，雷帕霉素合用RSL3組穿膜細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步減少（P＜0.01，圖2C）。

圖2 雷帕霉素增強(qiáng)RSL3對(duì)I-10細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用Fig.2 Rapamycin enhances the inhibitory effect of RSL3 on I-10 cell invasion and migration.A:Wounding-healing assay.B:Transwell assay for assessing migration of I-10 cells.C:Transwell assay for assessing invasion of I-10 cells(n=3,*P＜0.05,**P＜0.01,##P＜0.01,###P＜0.001).

2.3 雷帕霉素促進(jìn)RSL3誘導(dǎo)的I-10細(xì)胞鐵死亡

I-10細(xì)胞經(jīng)RSL3（2 μmol/L）、雷帕霉素（16 μmol/L）合用RSL3處理24 h后，使用GSH和MDA試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，單用RSL3組GSH含量下降（P＜0.01，圖3A），MDA含量明顯升高（P＜0.05，圖3A）；而與單用RSL3組相比，雷帕霉素合用RSL3組GSH的水平進(jìn)一步下降（P＜0.01，圖3A），MDA含量升高（P＜0.01，圖3A）；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組相比，單用RSL3組GPX4的表達(dá)水平下降（P＜0.01，圖3B），而與單用RSL3組相比，雷帕霉素合用RSL3組GPX4的表達(dá)水平進(jìn)一步下降（P＜0.05，圖3B）；C11BODIPY581/591熒光探針處理細(xì)胞后，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),相比于Control組，單用RSL3組細(xì)胞中l(wèi)ipid ROS的表達(dá)水平增加（P＜0.0001，圖3C），而與單用RSL3組相比，雷帕霉素合用RSL3組細(xì)胞中l(wèi)ipid ROS水平進(jìn)一步增加（P＜0.05，圖3C）。

圖3 雷帕霉素促進(jìn)RSL3誘導(dǎo)的I-10細(xì)胞鐵死亡Fig.3 Rapamycin promotes RSL3-induced ferroptosis in I-10 cells.A:GSH and MDA level.B:Western blotting for detecting the expression of GPX4.C:Cellular lipid ROS level analyzed with flow cytometry(n=3,*P＜0.05,**P＜0.01,****P＜0.0001,#P＜0.05,##P＜0.01).

3 討論

睪丸腫瘤是青壯年男性中最常見的腫瘤，生殖細(xì)胞腫瘤(TGCTs)占所有睪丸癌的大部分［17］。睪丸癌的基礎(chǔ)化療藥物以順鉑為主，然而順鉑的副作用較大、耐藥性的產(chǎn)生均限制了疾病的治療［18］。因此，課題組近年來主要在睪丸癌中，通過誘導(dǎo)細(xì)胞的多種死亡形式，以達(dá)到更滿意的抗腫瘤治療效果［19,20］。鐵死亡是一種由脂質(zhì)過氧化引起的鐵依賴性、非凋亡形式的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡［21］。生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)鐵離子水平處于動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，然而，癌細(xì)胞為了繼續(xù)生存，積累了大量的鐵離子。過量鐵離子沉積可以導(dǎo)致膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，以及過度氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量的脂質(zhì)ROS［22］。研究表明促進(jìn)細(xì)胞鐵死亡可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)，并提高腫瘤對(duì)化學(xué)治療和放射治療的敏感性［23］。谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）通過將脂質(zhì)氫過氧化物轉(zhuǎn)化為無毒的脂質(zhì)醇來防止鐵死亡［24］。GSH作為GPX4的主要輔因子，通過GSH與GS-SG之間的轉(zhuǎn)化，發(fā)揮電子供體或受體的作用，在抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。丙二醛是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量在鐵死亡過程中逐漸增加［25］。

RSL3是公認(rèn)的細(xì)胞鐵死亡的誘導(dǎo)劑，主要通過抑制GPX4的活性來促進(jìn)細(xì)胞的鐵死亡［26］。有文獻(xiàn)報(bào)道，RSL3可通過失活GPX4誘導(dǎo)3種不同的結(jié)直腸癌細(xì)胞系鐵死亡［27,28］，也可以在過表達(dá)GPX4的非小細(xì)胞肺癌中，誘導(dǎo)其發(fā)生鐵死亡，增加腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性［29］。然而RSL3能否誘導(dǎo)睪丸癌細(xì)胞鐵死亡尚未報(bào)道。為此，我們將RSL3作用于睪丸癌I-10細(xì)胞。本研究通過MTT結(jié)果可以看出，RSL3呈濃度依賴性降低睪丸癌細(xì)胞I-10的細(xì)胞活力。與對(duì)照組相比，RSL3能夠明顯降低I-10細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移能力，且鐵死亡相關(guān)指標(biāo)GSH 水平、GPX4蛋白水平明顯降低，Lipid ROS、MDA水平明顯升高。這表明，RSL3可以誘導(dǎo)睪丸癌細(xì)胞I-10發(fā)生鐵死亡。

雷帕霉素靶蛋白（TOR）是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。研究表明，mTOR可以調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖和代謝，mTOR的失調(diào)與多種腫瘤相關(guān)，如前列腺癌、乳腺癌等［30］。mTOR包括兩種蛋白復(fù)合物，對(duì)雷帕霉素敏感的mTORC1 和不受該藥物直接抑制的mTORC2［31］。mTORC1可以通過調(diào)節(jié)GPX4的表達(dá)、自噬發(fā)生以及脂質(zhì)代謝等多種途徑影響細(xì)胞對(duì)于鐵死亡的敏感性［32］。且有研究表明，mTOR參與了細(xì)胞的鐵死亡水平的調(diào)控。如阿司匹林通過抑制PIK3CA突變的結(jié)直腸癌中mTOR/SREBP-1/SCD1介導(dǎo)的脂肪生成來促進(jìn)RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡［33］，GYY4137（一種體內(nèi)外穩(wěn)定的新型H2S供體）通過抑制mTOR通路促進(jìn)自噬激活來阻斷CLP誘導(dǎo)的肺鐵死亡［34］。

雷帕霉素是一種特異性較高的mTORC1抑制劑，通常用作免疫抑制劑，目前已被批準(zhǔn)用于治療人類惡性腫瘤［35］。雷帕霉素是否能在睪丸癌中促進(jìn)細(xì)胞鐵死亡，并增強(qiáng)鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3的抗腫瘤作用呢？為此，我們將雷帕霉素與鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3聯(lián)合應(yīng)用于睪丸癌細(xì)胞I-10。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素合用RSL3組相對(duì)于單用RSL3組，I-10細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力有顯著下降。本研究也檢測(cè)了鐵死亡其他相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果顯示，相對(duì)于單用RSL3組，雷帕霉素合用RSL3組，I-10細(xì)胞內(nèi)GPX4蛋白表達(dá)明顯降低，Lipid ROS水平升高、GSH含量降低、丙二醛含量升高。這些現(xiàn)象表明，雷帕霉素可以促進(jìn)RSL3誘導(dǎo)的睪丸癌I-10細(xì)胞鐵死亡。

然而該研究仍有一定的局限性。第一，沒有針對(duì)于雷帕霉素增強(qiáng)RSL3抗腫瘤作用的機(jī)制進(jìn)一步研究。第二，沒有開展相應(yīng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，在睪丸癌細(xì)胞中，雷帕霉素能夠增強(qiáng)RSL3的抗腫瘤作用，該作用與增強(qiáng)了RSL3誘導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡有關(guān)。后續(xù)我們將深入研究雷帕霉素在增強(qiáng)RSL3誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡水平過程中的具體機(jī)制，為睪丸癌的臨床治療提供更多的理論依據(jù)。