茹浩浩 陳連勇 楊 星 陳 濤 閆雙群 許 琳

（云南省疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病防治所，云南 昆明 650022）

Xpert MTB/RIF是一種檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）及其利福平（rifampicin，RFP）耐藥性的半巢式實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)技術(shù)。這一技術(shù)是針對(duì)rpoB基因81 bp的利福平耐藥決定區(qū)（rifampicin resistance determining region，RRDR）設(shè)計(jì)引物和探針，檢測(cè)其是否發(fā)生突變，進(jìn)而診斷患者是否感染MTB，以及是否對(duì)RFP耐藥[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，Xpert MTB/RIF檢測(cè)RFP耐藥性具有較高的敏感性和特異性，與表型藥物敏感性試驗(yàn)（phenotypic drug susceptibility test，pDST）結(jié)果有較好的一致性，但也存在耐藥結(jié)果不一致的情況[2]。異質(zhì)性耐藥，即分離自患者樣本的菌株中，既有敏感株，又有耐藥株，是導(dǎo)致表型和基因型耐藥檢測(cè)結(jié)果不一致的主要原因[3]，全基因組測(cè)序（whole genome sequencing，WGS）可以發(fā)現(xiàn)這種異質(zhì)性耐藥[4]。為了了解Xpert MTB/RIF檢測(cè)RFP耐藥性和pDST結(jié)果的一致性，并分析2種方法檢測(cè)結(jié)果不一致的原因，本研究對(duì)2020年云南省耐藥監(jiān)測(cè)中行Xpert MTB/RIF檢測(cè)的672株MTB進(jìn)行比例法pDST。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2020年云南省耐藥監(jiān)測(cè)中行Xpert MTB/RIF檢測(cè)的672株MTB。Xpert MTB/RIF檢測(cè)由云南省耐藥監(jiān)測(cè)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，并將結(jié)果匯報(bào)至云南省疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室。收集患者基本信息和相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果。

1.2 儀器和試劑

改良中性羅氏培養(yǎng)基、含藥羅氏培養(yǎng)基購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。RFP藥物培養(yǎng)基內(nèi)藥物終濃度為40 μg/mL。

1.3 方法

1.3.1 菌種鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)

采用比例法進(jìn)行pDST。以MTB標(biāo)準(zhǔn)株（H37Rv）作為敏感對(duì)照，標(biāo)準(zhǔn)株由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3.2 測(cè)序

菌株滅活后，委托上海晶諾生物科技有限公司提取DNA并進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為美國(guó)Illumina公司Illumina二代測(cè)序平臺(tái)，雙端測(cè)序，測(cè)序平均深度100×以上。

1.3.3 WGS數(shù)據(jù)分析

用TB-profiler V4.0.3（https：//github.com/jodyphelan/TBProfiler/）分析測(cè)序Fastq原始數(shù)據(jù)，獲得菌株的耐藥基因突變特征。采用Trimmomatic軟件進(jìn)行質(zhì)控（去除接頭、引物序列、低質(zhì)量序列），以H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株為參考序列，用BWA和Samtools軟件進(jìn)行比對(duì)和排序，GATK4軟件標(biāo)記PCR重復(fù)，獲得bam文件，導(dǎo)入IGV V2.12軟件，參照H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株序列，查看是否存在異質(zhì)性耐藥的情況[5-6]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例或率表示。以pDST結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，采用四格表分析Xpert MTB/RIF檢測(cè)RFP耐藥的敏感性和特異性。

2 結(jié)果

2.1 Xpert MTB/RIF與pDST結(jié)果的一致性

672株MTB中，有36株pDST結(jié)果為RFP耐藥，其中Xpert MTB/RIF耐藥34株、敏感2株。636株pDST結(jié)果為RFP敏感菌株中，Xpert MTB/RIF耐藥17株、敏感619株。672株MTB中，有594株分離自初治患者，78株分離自復(fù)治患者。以pDST結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，672株MTB的RFP耐藥率為5.36%；初治患者菌株耐藥率為3.87%（23/594），復(fù)治患者菌株耐藥率為16.67%（13/78），Xpert MTB/RIF檢測(cè)RFP耐藥性的敏感性為94.44%、特異性為97.32%、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為66.67%、陰性預(yù)測(cè)值為99.52%。Xpert MTB/RIF檢測(cè)初治患者RFP耐藥的敏感性為95.65%、特異性為98.25%；Xpert MTB/RIF檢測(cè)復(fù)治患者RFP耐藥的敏感性為92.31%，特異性為89.23%。見表1。

表1 初治和復(fù)治患者Xpert MTB/RIF與pDST結(jié)果一致性 例

2.2 Xpert MTB/RIF與pDST不一致結(jié)果WGS分析

672株MTB中，有19株（2.83%）Xpert MTB/RIF與pDST結(jié)果不一致。2株Xpert MTB/RIF顯示RFP敏感，pDST顯示耐藥菌株中，有1株未檢出耐藥突變，1株檢出rpoB-Ile491Phe突變；17株Xpert MTB/RIF顯示RFP耐藥，pDST顯示敏感的菌株中，檢出rpoB-Leu452Pro突變、rpoB-Ser450Leu突變各4株，rpoB-Leu430Pro突變3株，rpoB-His445Asn突變2株，rpoBAsp435Tyr突變、rpoB-His445Asp突變、rpoBHis445Ser突變和rpoB-Ser450Trp突變各1株。共18株MTB發(fā)生RFP耐藥相關(guān)突變，在突變位點(diǎn)完全純合的MTB有6株，其余12株均有1～3個(gè)短序列（reads）為野生型（即未發(fā)生突變），未發(fā)生突變的reads所占比例最高[1.56%（3/192）]。1株未檢出RFP耐藥相關(guān)突變的MTB，在rpoB基因RRDR區(qū)也未發(fā)現(xiàn)明顯的異質(zhì)性耐藥。另外，18株WGS檢出RFP耐藥相關(guān)突變的菌株中，有10株同時(shí)檢出其他藥物耐藥相關(guān)突變：包括氟喹諾酮耐藥相關(guān)gyrA基因突變4株，異煙肼耐藥相關(guān)ahpC、fabG1、katG基因突變5株，阿米卡星耐藥相關(guān)rrs-1401A＞G突變1株；其他8株僅發(fā)生RFP耐藥相關(guān)突變（rpoB-452位點(diǎn)突變3株，rpoB-450位點(diǎn)突變3株，rpoB-445位點(diǎn)突變1株，rpoB-430位點(diǎn)突變1株）。部分（2株）rpo-450突變菌株突變位點(diǎn)可視化圖見圖1。

圖1 部分（2株）rpoB-450突變菌株突變位點(diǎn)可視化圖

3 討論

本研究中，Xpert MTB/RIF與pDST檢測(cè)RFP耐藥結(jié)果有較好的一致性。以pDST結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF檢測(cè)RFP耐藥有較高的敏感性和特異性，在初治患者和復(fù)治患者中敏感性均較高，在復(fù)治患者中的特異性稍低于初治患者，與其他研究結(jié)果[7-8]一致，提示無(wú)論對(duì)于初治患者，還是對(duì)于復(fù)治患者，Xpert MTB/RIF檢測(cè)RFP耐藥均有較好的效能。

本研究中，2株Xpert MTB/RIF顯示RFP敏感、pDST顯示耐藥的MTB中，WGS未檢出耐藥突變1株，提示可能存在已知RFP耐藥突變以外的其他類突變或外排泵機(jī)制；另外，有1株為rpoB-Ile491Phe突變，該突變位于RRDR外，屬于罕見突變，因在Xpert MTB/RIF檢測(cè)靶點(diǎn)范圍外，故未被檢測(cè)到。17株Xpert MTB/RIF顯示RFP耐藥、pDST顯示敏感的MTB中，WGS均檢出RFP耐藥相關(guān)的rpoB基因突變，其中rpoBLeu452Pro突變4株、rpoB-Leu430Pro突變3株。王希江等[9]發(fā)現(xiàn)，rpoB-452位點(diǎn)突變對(duì)應(yīng)低濃度耐藥，不建議將rpoB-Leu430Pro突變列為RFP耐藥相關(guān)突變。本研究有10株MTB雖然發(fā)生rpoB-Ser450Leu等RFP中、高濃度耐藥突變[9]，但pDST結(jié)果依然為RFP敏感，原因可能為：1）pDST雖然是藥物敏感性試驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)，但比例法pDST為手工操作，受操作者、試劑、環(huán)境等因素的影響，結(jié)果可能存在一定誤差；2）異質(zhì)性耐藥。本研究有18株檢出RFP耐藥相關(guān)突變的MTB中，突變位點(diǎn)完全純合的有6株，其余12株中均未發(fā)生突變的reads所占比例最高[1.56%（3/192）]，提示這些菌株中雖然普遍存在較低的異質(zhì)性，但發(fā)生RFP耐藥相關(guān)突變菌群的比例遠(yuǎn)大于敏感菌群，而比例法pDST理論上可以檢測(cè)出耐藥亞群比例≥1%的耐藥菌[4]。這些菌株雖然發(fā)生了rpoB-Ser450Leu等中、高水平耐藥突變，但pDST結(jié)果依然為RFP敏感的主要原因可能是pDST的不穩(wěn)定性，而不是異質(zhì)性耐藥。

綜合以上結(jié)果，Xpert MTB/RIF與pDST檢測(cè)RFP耐藥結(jié)果不一致時(shí)，除Probe A探針突變外（包含rpoB-430位點(diǎn)），只要其中1種方法顯示RFP耐藥，均應(yīng)視為耐藥。根據(jù)這個(gè)原則，結(jié)合WGS結(jié)果綜合判斷，本研究中可判定RFP耐藥的MTB為50株，據(jù)此判斷，Xpert MTB/RIF檢測(cè)RFP耐藥性的敏感性為96.00%、特異性為99.52%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為94.12%，陰性預(yù)測(cè)值為99.68%。與本研究類似，國(guó)外也有研究證實(shí)Xpert MTB/RIF與基因測(cè)序檢測(cè)RFP耐藥結(jié)果的一致性高于pDST，Xpert MTB/RIF與pDST中RFP耐藥結(jié)果不一致的樣本通過(guò)參考基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行校正后，敏感性和特異性也有一定的提升[8]。既往研究中，因?yàn)樵诘蚏FP耐藥率患者中較低的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，往往認(rèn)為Xpert MTB/RIF應(yīng)優(yōu)先用于RFP耐藥率較高的定點(diǎn)醫(yī)院，以及耐多藥高危人群[2]。本研究藥物敏感性以綜合判定結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，校正Xpert MTB/RIF檢測(cè)RFP耐藥性的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為94.12%，這說(shuō)明在RFP耐藥率較低的人群中，Xpert MTB/RIF檢測(cè)獲得的RFP耐藥結(jié)果比較可靠。同時(shí)，根據(jù)綜合判斷，RFP耐藥率為7.44%（50/672），比僅依靠pDST的RFP耐藥率[5.36%（36/672）]提高了2.08%。既往云南省耐藥監(jiān)測(cè)主要參考pDST結(jié)果，所以RFP耐藥率可能在一定程度上被低估。全國(guó)范圍的大樣本量的數(shù)據(jù)也證實(shí)WGS檢測(cè)到的幾乎所有藥物的耐藥率都高于pDST[10]，而既往云南省耐藥監(jiān)測(cè)中RFP耐藥率為6.38%～8.71%，耐多藥率為3.78%～7.46%[11-13]，根據(jù)2016年的數(shù)據(jù)[12]，推測(cè)云南省實(shí)際的R F P 耐藥率約為8.00%，提示未來(lái)有必要將WGS應(yīng)用到耐藥監(jiān)測(cè)中，以提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。

此外，本研究17株Xpert MTB/RIF顯示RFP耐藥而pDST顯示RFP敏感的菌株中，有8株僅發(fā)生RFP耐藥相關(guān)突變（rpoB-452位點(diǎn)突變3株，rpoB-450位點(diǎn)突變3株，rpoB-445位點(diǎn)突變1株，rpoB-430位點(diǎn)突變1株），占47.06%。提示有可能合并發(fā)生了其他藥物耐藥相關(guān)突變菌株的RFP耐藥水平要高于僅發(fā)生RFP耐藥相關(guān)突變的菌株，這需要后續(xù)研究通過(guò)最低抑菌濃度法藥物敏感性試驗(yàn)和WGS相結(jié)合來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。