趙 飛，張 武，張毓秀，劉婷婷，韓明月，吳玉凡，李 艷

(天津市農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，天津 300193)

柑橘因富含大量糖分、維生素、及礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)成為深受我國國民喜愛的水果之一。新煙堿類農(nóng)藥作為第四代殺蟲劑，具有高效、廣譜及良好的根部內(nèi)吸性、觸殺和胃毒作用等特點(diǎn)[1]，其中吡蟲啉、啶蟲脒、噻蟲胺、噻蟲嗪等殺蟲劑常在柑橘種植過程中使用。此類農(nóng)藥具有沸點(diǎn)高，熱穩(wěn)定性差，分子量大的特點(diǎn)，不適合采用氣相色譜儀(GC)，氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(GC-MS)對其殘留進(jìn)行檢測[2]，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-MS/MS)結(jié)合了液相色譜的高分離能力以及質(zhì)譜的分析范圍廣、靈敏度高的特點(diǎn)，適用于新煙堿類農(nóng)藥的分析。目前關(guān)于柑橘中同時(shí)檢測這四種新煙堿類農(nóng)藥的研究相對較少且之前的相關(guān)研究所采用得前處理方式大多是固相萃取法，這類方法需大量有機(jī)試劑及諸多前處理儀器，成本較高且過程復(fù)雜、耗時(shí)長[3-5]。本文采用提取液經(jīng)N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基鍵合硅膠(C18)等材料凈化，上清液直接上機(jī)檢測的方法，使用LC-MS/MS對柑橘中吡蟲啉、啶蟲脒、噻蟲胺、噻蟲嗪四種新煙堿類農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測，并對提取液及凈化材料進(jìn)行了優(yōu)化。旨在節(jié)約前處理成本，縮短檢測時(shí)間，提高檢測效率，降低基質(zhì)的干擾性，提升檢測的準(zhǔn)確度。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 實(shí)驗(yàn)儀器：Thermo TSQ Quantum Access 三重四級桿串聯(lián)液質(zhì)聯(lián)用儀；JJ200電子天平；BP211D 電子微量天平；3K-15高速離心機(jī)。

實(shí)驗(yàn)試劑、耗材及標(biāo)準(zhǔn)品：乙腈(色譜純)，甲醇(色譜純)，甲酸(分析純)，氯化鈉(NaCl)，無水硫酸鎂(MgSO4)，無水醋酸鈉，乙酸銨，PSA，C18(以上固體試劑均為分析純)。濾膜：0.2 μm，有機(jī)過濾膜。吡蟲啉、啶蟲脒、噻蟲胺、噻蟲嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液，溶度均為1 000 mg/L。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置 準(zhǔn)確吸取吡蟲啉、啶蟲脒、噻蟲胺、噻蟲嗪單個(gè)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，用甲醇做溶劑，定容至10 mL，配制成100 mg/L濃度的單標(biāo)溶液。各取1 mL單標(biāo)溶液，用甲醇做溶劑，定容至10 mL，配制成10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。使用柑橘空白基質(zhì)提取液將10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液稀釋為5、10、20、50、80、100、200 μg/L。

1.3 樣品前處理 提取 稱取10 g(精確至0.01 g)已勻漿的柑橘樣品于50 mL塑料離心管中，加入10 mL 0.5%甲酸-乙腈封閉浸泡1 min，隨后劇烈振蕩l min，加入2 g氯化鈉、1 g無水醋酸鈉，劇烈振蕩l min后5 000 r/min離心5 min。

凈化 定量吸取4 mL上清液至裝有PSA，C18，MgSO4等凈化材料的15 mL塑料離心管中，劇烈振蕩l min，冰浴5 min后渦旋30 s混勻。5 000 r/min離心5 min，吸取1 mL上清液過0.2 μm微孔濾膜，待測定。

1.4儀器條件

1.4.1 液相色譜條件 色譜柱：HyperisilGold，2.1 mm ×l00 mm，粒徑5 μm；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；色譜柱溫度：25 ℃；流動相：A相為5 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)溶液，B相為甲醇溶液，流動相梯度(表1)。

表1 流動相及其梯度條件(VA + VB)

1.4.2 質(zhì)譜條件 電離方式：電噴霧電離(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測 (MRM)；離子源參數(shù)參考條件：毛細(xì)管電壓：5 500 V，離子傳輸毛細(xì)管溫度：350 ℃；霧化氣：0.345 MPa；輔助加熱氣：0.345 MP4種農(nóng)藥質(zhì)譜參數(shù)(表2)。

表2 4種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)

2 檢測結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 本研究采用外標(biāo)法定量，將配制好的5～120 μg/L之間7個(gè)濃度點(diǎn)的空白基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.4.1的液相色譜條件及1.4.2的質(zhì)譜條件下上機(jī)檢測，以溶液濃度 (x)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，4種農(nóng)藥的空白基質(zhì)圖譜(圖1)，空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜(圖2)，空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，回歸方程及相關(guān)系數(shù)(表3)。結(jié)果表明，4種農(nóng)藥在范圍內(nèi)，質(zhì)譜峰面積與農(nóng)藥濃度間呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(R2)均>0.999。

圖1 4種農(nóng)藥的柑橘樣品空白圖譜

圖2 4種農(nóng)藥的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜(50 μg/L)

圖3 4種農(nóng)藥的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(5～200 μg/L)

表3 4種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.2 方法的回收率、精密度及靈敏度 在空白柑橘樣品中分別添加5、10、20 μg/kg的3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每個(gè)添加水平設(shè)6個(gè)平行樣品，混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液添加后將樣品封閉靜置30 min，按照1.3的條件進(jìn)行樣品前處理，在1.4.1的液相色譜條件及1.4.2的質(zhì)譜條件下上機(jī)檢測，10 μg/kg添加水平下的加標(biāo)樣品圖譜(圖4)。計(jì)算4種農(nóng)藥在各加標(biāo)水平下的平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果(表4)。4種農(nóng)藥在3個(gè)添加水平下的平均回收率在85%～93.5%，RSD<7.2%，符合農(nóng)藥殘留檢測的要求，檢測效果良好。

圖4 樣品添加回收圖譜(10 μg/kg)

表4 4種農(nóng)藥在各水平添加下的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.3 實(shí)際樣品檢測 使用本研究的方法對購自不同市場的30個(gè)柑橘樣品中這4種新煙堿類農(nóng)藥的殘留進(jìn)行檢測，每個(gè)樣品做雙樣檢測。其中有2個(gè)樣品有檢出，檢出的農(nóng)藥為啶蟲脒和噻蟲嗪，但是檢出值均未超出該農(nóng)藥的最大允許殘留限量[6]。

3 分析與討論

3.1 基質(zhì)效應(yīng)的考察 基質(zhì)效應(yīng)(ME：Matrix Effect)指樣品基質(zhì)中的一種或多種非目標(biāo)物組分對待測目標(biāo)物濃度的檢測準(zhǔn)確度的影響[7]。本實(shí)驗(yàn)比較使用乙腈為溶劑的試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和使用空白柑橘基質(zhì)提取液為溶劑的空白基質(zhì)曲線，選取5～120 μg/L之間7個(gè)濃度點(diǎn)在1.4.1的液相色譜條件及1.4.2的質(zhì)譜條件下上機(jī)檢測，以溶液濃度 (x)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線?；|(zhì)效應(yīng)可通過公式計(jì)算：ME(%)=空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率-試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的敘率)/試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率×100。ME的絕對值大小代表基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱，分為3個(gè)級別：|ME|<20%，是弱基質(zhì)效應(yīng)；20%<|ME|<50%，是中等強(qiáng)度基質(zhì)效應(yīng)；|ME|>50%，是強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)[8]。結(jié)果(表5)，4種農(nóng)藥的|ME|都在20%左右，表現(xiàn)為中弱強(qiáng)度基質(zhì)效應(yīng)，為了降低基質(zhì)效應(yīng)對檢測結(jié)果的影響，本研究使用空白柑橘基質(zhì)提取液為溶劑配制空白基質(zhì)曲線。

表5 4種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)

3.2 提取試劑的選擇 分別使用乙腈、0.5% 甲酸-乙腈、乙酸乙酯作為提取劑對添加濃度為0.05 mg/kg的加標(biāo)樣品進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯作為提取劑時(shí)樣品渾濁，共萃取物較多，回收率偏低，在70%～80%，這是因?yàn)樾聼焿A類農(nóng)藥極性較大，乙酸乙酯難以將其從含水基質(zhì)中完全提出。乙睛的溶解性好，滲透力強(qiáng)，乙睛作為提取劑，回收率范圍為75%～85%，考慮到提取劑通過適當(dāng)?shù)乃峄?，能促使更多農(nóng)藥從樣品組織中溶出，使用0.5% 甲酸-乙腈與純乙腈進(jìn)行比較，酸化乙腈作為提取劑的回收率達(dá)到了80%～90%。經(jīng)過對比，本研究選用0.5% 甲酸-乙腈作為提取劑。

3.3 凈化材料的優(yōu)化 柑橘中含有大量的糖類、維生素、纖維素、單萜等化合物類揮發(fā)油成分[9]，有效的去除基質(zhì)中的糖類及揮發(fā)油成分是凈化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。PSA可高效凈化基質(zhì)中的糖類及部分色素，C18可以凈化基質(zhì)中的脂類，MgSO4可有效吸附提取液中水分。為了優(yōu)化凈化效果，本研究選擇了5種凈化材料組合進(jìn)行了對比：A：100 mg PSA+50 mg C18+900 mg MgSO4；B：150 mg PSA+900 mg MgSO4；C：150 mg PSA+50 mg C18+900 mg MgSO4；D：150 mg PSA+100 mg C18+900 mg MgSO4；E：200 mg PSA+100 mg C18+900 mg MgSO4，分別使用5種凈化材料組合對添加濃度為20 μg/kg的加標(biāo)樣品進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，考察4種農(nóng)藥的回收率，結(jié)果(圖5)，組合C和組合D都達(dá)到了良好的回收率，這表明150 mg PSA對糖類及部分色素的凈化效果最佳，C18有效的凈化了柑橘中的揮發(fā)油成分。從節(jié)約成本的角度考慮，選擇組合C作為凈化材料組合。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)提取液中加入MgSO4會出現(xiàn)比較嚴(yán)重的放熱現(xiàn)象，考慮到4種農(nóng)藥的熱不穩(wěn)定性，在加入凈化材料震蕩后，采用冰浴的方式降溫來提高回收率。

圖5 不同凈化材料組合對4種農(nóng)藥回收率的影響

4 總結(jié)

本研究建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定柑橘中4種新煙堿類農(nóng)藥殘留的分析方法，采用外標(biāo)法定量，建立了空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。在0.005～0.2 mg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，加標(biāo)回收率范圍為85%～93.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為5.2%～7.2%。定量限為0.005 mg/kg，滿足國家對這4種農(nóng)藥在柑橘中最大殘留限量的檢測要求。本實(shí)驗(yàn)方法具有靈敏度高、操作簡便、檢測準(zhǔn)確、精密度高等多個(gè)優(yōu)點(diǎn)，適用于柑橘中吡蟲啉、啶蟲脒、噻蟲胺、噻蟲嗪4種新煙堿類農(nóng)藥殘留的快速檢測。