馬 臣，于福利，曹 宇

(陜西省農(nóng)業(yè)檢驗檢測中心，陜西 西安 710003)

1 前言

大黃素甲醚化學(xué)名稱為1，8-二羥基-3-甲氧基-6-甲基蒽醌，分子式為C16H21O5，母藥為黃色粉末或膏狀，熔點(diǎn)203～207℃[1]。大黃素甲醚是從中草藥蓼科植物大黃的根、莖中提取的一種植物源農(nóng)藥，屬蒽醌類化合物。該成分是一種植物次生代謝產(chǎn)物，具有防治植物病害的作用。其作用機(jī)理主要為抑制細(xì)菌的糖及糖代謝中間產(chǎn)物的氧化、脫氫，抑制蛋白質(zhì)和核酸的合成。室內(nèi)活性測定和田間藥效試驗結(jié)果表明，對黃瓜白粉病有良好的抑制和防治效果[2]。本文介紹了一種用高效液相色譜法可簡便、快速分離測定樣品中大黃素甲醚，保留時間合理，精密度與準(zhǔn)確度較高，且線性關(guān)系和特異性良好，可作為企業(yè)生產(chǎn)過程質(zhì)量控制和質(zhì)檢機(jī)構(gòu)質(zhì)量檢測的參考方法。

2 試驗部分

2.1 試劑和溶液 甲醇：色譜純；丙酮：色譜純；水：超純水；磷酸：分析純；磷酸溶液：Ψ(磷酸：水)=5：1 000;大黃素甲醚標(biāo)樣:已知質(zhì)量分?jǐn)?shù),ω≥99.2%;0.8%大黃素甲醚懸浮劑。

2.2 儀器 高效液相色譜儀:Agilent 1260,具有二極管陣列檢測器和自動進(jìn)樣器;Agilent色譜工作站;Millipore超純水制備系統(tǒng);色譜柱:150 mm×4.6 mm(i.d.)不銹鋼柱,內(nèi)裝ZORBAX SB-C18、5 μm填充物;恒溫水浴鍋。

2.3 液相色譜操作條件 流動相:Ψ(甲醇：磷酸溶液)=85：15,經(jīng)濾膜過濾,并進(jìn)行脫氣;流量:1.0 mL/min;柱溫:30℃;檢測波長:225 nm;進(jìn)樣體積:5 μL;保留時間:大黃素甲醚約7.4 min。

上述液相色譜操作條件,系典型操作參數(shù),可根據(jù)不同儀器特點(diǎn),對給定的操作參數(shù)做適當(dāng)調(diào)整,以期獲得最佳效果。典型的大黃素甲醚的標(biāo)樣、樣品色譜圖(圖1、2)。

2.4 測定步驟

2.4.1 標(biāo)樣溶液的配制 稱取0.05 g(精確至0.000 1 g)大黃素甲醚標(biāo)樣于100 mL容量瓶中,加入70 mL丙酮,超聲波振蕩5 min,冷卻至室溫,用丙酮稀釋至刻度并搖勻,用移液管移取上述溶液10.0 mL于50 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,搖勻。

2.4.2 試樣溶液的配制 稱取含0.05 g(精確至0.000 1 g)大黃素甲醚的試樣于100 mL容量瓶中,加入70 mL丙酮,超聲波振蕩5 min,冷卻至室溫,用丙酮稀釋至刻度并搖勻,用移液管移取上述溶液10.0 mL于50 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,搖勻,過濾。

2.4.3 測定 在上述操作條件下,待儀器基線穩(wěn)定后,連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液,各針相對響應(yīng)值變化<1.5%時,按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)樣測定。

2.4.4 計算 將測得的2針試樣溶液及試樣溶液前后2針標(biāo)樣溶液中大黃素甲醚的峰面積分別進(jìn)行平均,按下式計算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%):

式中:A1—標(biāo)樣溶液中大黃素甲醚峰面積的平均值;
A2—試樣溶液中大黃素甲醚峰面積的平均值;
m1—標(biāo)樣的質(zhì)量,g;
m2—試樣的質(zhì)量,g;
ω—標(biāo)樣中大黃素甲醚的質(zhì)量分?jǐn)?shù),%。

3 結(jié)果分析

3.1 色譜條件選擇 色譜柱選擇常用的ZORBAX SB-C18反相柱。根據(jù)大黃素甲醚物化性質(zhì)、溶劑的紫外吸收波長,選擇丙酮作為溶劑溶解樣品,并以甲醇和0.5%磷酸水溶液作為流動相。為了得到更好的分離效果和峰形,將流動相按不同比例在色譜柱上進(jìn)行試驗,隨著甲醇比例的增加,保留時間減小,當(dāng)甲醇與0.5%磷酸水溶液比例達(dá)到90：10時,有雜質(zhì)峰干擾大黃素甲醚,峰純度達(dá)不到試驗要求,最終選擇Ψ(甲醇： 0.5%磷酸水溶液)=85：15作為流動相,流速1.0 mL/min。該條件下,大黃素甲醚色譜峰峰形較好,與雜質(zhì)能完全分離,具有良好的精密度和準(zhǔn)確度(圖3)。

3.2 檢測波長的選擇 大黃素甲醚的紫外光譜圖(圖4),從圖中可以看到大黃素甲醚的最大吸收波長約在225 nm處,在該波長處靈敏度較高,干擾較少,能夠滿足分析的要求,故將檢測波長確定為225 nm。

圖4 大黃素甲醚的紫外光譜圖

圖5 大黃素甲醚線性關(guān)系圖

3.3 分析方法的線性相關(guān)性試驗 按標(biāo)樣溶液的制備方法配制5個不同濃度的有效成分線性相關(guān)溶液。在上述操作條件下,待儀器穩(wěn)定后,按照STD1至STD5的順序測定每個溶液中大黃素甲醚的峰面積,取2次測定的平均結(jié)果(表1)。以大黃素甲醚質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)為Y=159.36x+1 432.5,R2=0.999 9。

表1 我國現(xiàn)有登記防治油菜病蟲草害的農(nóng)藥品種情況

3.4 分析方法的精密度試驗 按上述色譜操作條件對同一樣品平行5次進(jìn)行測定,測得標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.007 1;變異系數(shù)為1.7%。(表2)。

表2 分析方法的精密度試驗結(jié)果

3.5 分析方法的準(zhǔn)確度試驗 從已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的樣品中稱取5個試樣,分別加入一定量的大黃素甲醚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),在上述色譜操作條件下進(jìn)行分析,測得大黃素甲醚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的平均回收率為99.89% (表3)。

表3 分析方法的準(zhǔn)確度試驗結(jié)果

3.6 方法特異性 本試驗采用HPLC-DAD峰純度分析法來鑒別大黃素甲醚。大黃素甲醚標(biāo)樣、0.8%大黃素甲醚懸浮劑中的大黃素甲醚HPLC-DAD峰純度均>990,有效成分處無其它物質(zhì)干擾,符合定量分析要求。峰純度色譜圖(圖6、7)。

圖6 大黃素甲醚標(biāo)樣HPLC-DAD峰純度色譜圖

4 結(jié)論

試驗結(jié)果表明,本文建立的HPLC分析方法,保留時間合理,精密度與準(zhǔn)確度較高,且線性關(guān)系和特異性良好,可快速分離測定樣品中大黃素甲醚,符合農(nóng)藥產(chǎn)品的質(zhì)量分析要求。本方法具有簡便、快速、準(zhǔn)確、分離效果好等特點(diǎn),是一種比較實(shí)用的方法。