任 婧,王登奎,楊瑞娜,袁小志,劉志偉,王新帥

食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)作為食管癌中的主要組織學(xué)類型,在我國發(fā)病率和死亡率均較高[1]。目前對于食管癌的治療主要是手術(shù)、放療、化療、靶向治療和綜合治療,依據(jù)患者病情,選擇個(gè)體合適的治療方案,可顯著延長患者總生存期。近年來,免疫治療手段作為一種新的抗腫瘤治療方式已在腫瘤研究中不斷取得進(jìn)展。腫瘤的免疫治療是指激活人體免疫系統(tǒng),通過自身免疫功能抑制“免疫逃逸”,發(fā)揮抗腫瘤作用[2]。其治療方式是通過藥物重新啟動(dòng)建立體內(nèi)免疫系統(tǒng)對腫瘤的清除,恢復(fù)體內(nèi)抗腫瘤免疫反應(yīng)。目前已有的免疫治療藥物有免疫檢查點(diǎn)抑制劑、腫瘤相關(guān)疫苗、小分子抑制劑等等。近年來,腫瘤免疫治療已在多種腫瘤治療中取得了巨大的成就,如黑色素瘤、腎癌、非小細(xì)胞肺癌等等。此外,最新食管癌治療指南支持PD-1抑制劑可作為晚期一線、晚期二線食管癌治療新標(biāo)準(zhǔn)。并且,免疫聯(lián)合放化療在食管癌治療中已證實(shí)出安全性和可行性。表明免疫治療在食管鱗癌治療中的可行性。基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)是指將數(shù)個(gè)基因組成的基因集與整個(gè)轉(zhuǎn)錄組、修飾組等做出簡單而清晰的關(guān)聯(lián)分析,相比于差異基因富集分析,GSEA是從全體基因的表達(dá)矩陣中找出具有協(xié)同差異的基因集,故能兼顧差異較小的基因。鑒于免疫治療在食管鱗癌治療中的潛力,且為了更好地助力食管鱗癌的免疫治療研究,作者基于生物信息學(xué)分析展開了此次研究。

1 資料和方法

1.1 資料來源在GEO公共基因數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中,以“ESOPHAGEAL SQUAMOUS CELL CARCIONMA”為關(guān)鍵詞檢索,下載包括ESCC及癌旁組織基因芯片數(shù)據(jù)集GSE20347。

1.2 基因集富集分析和核心基因鑒定運(yùn)用R軟件(4.0.4版本)中clusterProfiler包對基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行基因集富集分析,挑選免疫相關(guān)通路并鑒定通路中核心基因進(jìn)行下一步分析。

1.3 預(yù)后、免疫浸潤分析和PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建為了探索本研究鑒定的基因表達(dá)量,作者基于UALCAN數(shù)據(jù)庫(https://ualcan.path.uab.edu/index.html)分析核心基因與食管癌患者臨床特征相關(guān)性。HPA人類蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https://www.proteinatlas.org/)是包含蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組等多組學(xué)的數(shù)據(jù)庫,依據(jù)其單細(xì)胞數(shù)據(jù),分析核心基因在細(xì)胞中表達(dá)分布,探究細(xì)胞間是否存在互作關(guān)系。在THE KAPLAN-MEIER PLOTTER (http://kmplot.com/analysis/index.php p=background)和TIMER2.0(http://timer.cistrome.org/)中分別進(jìn)行核心基因生存預(yù)后分析及核心基因在食管癌組織中與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性分析?；贕ENEMANIA(http://genemania.org/)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用(PROTEIN-PROTEIN INTERACTION,PPI)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測基因功能[3]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,基因集富集分析采用多重假設(shè)檢驗(yàn)矯正。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)處理GSE20347平臺(tái)信息為GPL571[HG-U133A_2] AFFMETRIX HUMAN GENOME U133A 2.0 ARRAY,且GSE20347基因芯片共有34例樣本包含17例ESCC組織及17例癌旁組織,經(jīng)R軟件標(biāo)準(zhǔn)化及探針轉(zhuǎn)換處理,共得到12 402個(gè)基因表達(dá)數(shù)據(jù)集。

2.2 基因集富集分析和核心基因鑒定運(yùn)用clusterProfiler 包對基因表達(dá)矩陣進(jìn)行基因集富集分析,結(jié)果如圖1所示,共得到15個(gè)免疫相關(guān)通路:免疫效應(yīng)過程、白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、免疫效應(yīng)過程中的負(fù)調(diào)控、免疫受體的體細(xì)胞多樣化、單一位點(diǎn)內(nèi)通過種系重組免疫受體的體細(xì)胞多樣化、免疫球蛋白的體細(xì)胞多樣化、體液免疫負(fù)調(diào)節(jié)、B細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)、B細(xì)胞活化參與免疫反應(yīng)、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)免疫、免疫球蛋白產(chǎn)生、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)、通過體細(xì)胞突變實(shí)現(xiàn)免疫受體的體細(xì)胞多樣化、體液免疫應(yīng)答、調(diào)節(jié)免疫球蛋白產(chǎn)生,依據(jù)通路中基因RANK排名,鑒定出15個(gè)核心基因(UTP18、PTPN14、UMPS、ATAD5、BCL11B、ATM、CTNNBL1、SCCPDH、TNFSF4、MICA、POLB、TUBA1C、UNG、EHMT2、PKN1)。

圖1 基因集富集分析

2.3 預(yù)后及腫瘤免疫浸潤分析基于KM plotter數(shù)據(jù)庫對核心基因進(jìn)行預(yù)后評估,生存預(yù)后結(jié)果如圖2所示15個(gè)核心基因中ATAD5、ATM、EHMT2、PTPN14、UTP18基因高表達(dá)與ESCC患者較好的總生存期(overall survival,OS)顯著相關(guān)(P<0.05)。進(jìn)一步分析預(yù)后相關(guān)的核心基因與食管癌患者腫瘤分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系,結(jié)果如圖3和圖4所示,對比正常組織,免疫基因與腫瘤分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05),且腫瘤的分級和分期越高,部分基因的表達(dá)量越高。細(xì)胞測序結(jié)果分析(圖5)提示EHMT2、ATAD5和UTP18在鱗狀上皮細(xì)胞和B細(xì)胞中表達(dá)分布豐富,ATM在免疫細(xì)胞中表達(dá)分布較豐富,PTPN14主要富集于內(nèi)皮細(xì)胞中?？紤]到核心基因在免疫細(xì)胞中分布豐富,我們進(jìn)一步行腫瘤免疫浸潤分析,結(jié)果如圖6所示,CD4+T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤水平與ATAD5、UTP18、ATM和PTPN14表達(dá)水平呈正相關(guān),而與EHMT2表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。樹突狀細(xì)胞浸潤水平與ATAD5、ATM和PTPN14表達(dá)水平呈正相關(guān),與UTP18和EHMT2表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。B細(xì)胞浸潤水平與ATAD5和UTP18表達(dá)水平呈正相關(guān)。CD8+T細(xì)胞浸潤水平與ATM、EHMT2和PTPN14表達(dá)水平呈正相關(guān)。

圖2 免疫基因OS評估

圖3 免疫基因在不同分級表達(dá)量

圖4 免疫基因在不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移表達(dá)量

圖5 免疫基因單細(xì)胞亞群分布熱圖

圖6 腫瘤免疫浸潤分析

2.4 核心基因網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建基于GeneMANIA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建核心基因的PPI網(wǎng)絡(luò),如圖7所示,參與網(wǎng)絡(luò)的基因主要涉及功能包括組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性、細(xì)胞周期的正調(diào)控、細(xì)胞周期阻滯的正調(diào)控、細(xì)胞周期過程的正調(diào)控、DNA損傷檢查點(diǎn)、細(xì)胞周期檢測點(diǎn)。

圖7 核心基因PPI網(wǎng)絡(luò)及功能構(gòu)建

3 討論

食管癌治療是腫瘤治療的難點(diǎn)和熱點(diǎn)[4]。腫瘤微環(huán)境是體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長的內(nèi)外環(huán)境,與腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移相關(guān),且腫瘤微環(huán)境中不僅有腫瘤細(xì)胞,還包括免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、結(jié)締組織等,微環(huán)境中浸潤的免疫細(xì)胞作為癌癥的特殊生物標(biāo)志物顯著影響腫瘤的診斷、生存預(yù)后和臨床抗腫瘤效果。此外,腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制細(xì)胞可以通過影響免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞識(shí)別更進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。腫瘤免疫浸潤分析可幫助研究人員開發(fā)新型癌癥診斷和治療策略。本研究通過基因集富集分析鑒定出ESCC基因集主要參與的免疫相關(guān)通路(免疫效應(yīng)過程、白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、免疫效應(yīng)過程中的負(fù)調(diào)控等)和通路中的核心基因。生存預(yù)后提示核心基因中ATAD5、ATM、EHMT2、PTPN14、UTP18基因高表達(dá)與ESCC患者較好的OS顯著相關(guān)。且核心基因的表達(dá)與腫瘤分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。此外,單細(xì)胞測序提示核心基因在鱗狀上皮及免疫細(xì)胞中表達(dá)豐度較高,提示免疫細(xì)胞與鱗狀細(xì)胞可能通過這些核心基因位點(diǎn)進(jìn)行互作,而且核心基因腫瘤免疫浸潤分析結(jié)果顯示ESCC組織中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞的浸潤水平與核心基因表達(dá)水平存在相關(guān)性。這些免疫通路可能參與腫瘤微環(huán)境的改變,而通路中的核心基因會(huì)影響免疫通路整體的效價(jià),并且核心基因會(huì)導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境內(nèi)免疫細(xì)胞水平的改變可能會(huì)進(jìn)一步加速腫瘤的免疫逃逸。這些瀑布反應(yīng)會(huì)使得體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞惡性程度更高。而且,通過構(gòu)建基因網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)核心基因主要調(diào)控細(xì)胞周期、DNA損傷檢查點(diǎn)和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性。結(jié)果表明核心基因在調(diào)控免疫通路的同時(shí)還能影響細(xì)胞內(nèi)的增殖周期、蛋白修飾、DNA損傷修復(fù)等等。總的來說,核心基因不僅影響體內(nèi)腫瘤生存的微環(huán)境,還同時(shí)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的代謝,而細(xì)胞內(nèi)外的改變可能會(huì)使得腫瘤細(xì)胞惡性程度更高。

核心基因的進(jìn)一步分析同樣更加重要。ATAD5是一種AAA+ ATP酶蛋白,可與RFC2-5形成選擇性復(fù)制因子C樣復(fù)合體(ribasome lamellar complex, RLC),對于維持基因組穩(wěn)定性非常重要[5]。既往HeLa和酵母細(xì)胞研究表明,免疫球蛋白重鏈(Igh)重組、B細(xì)胞分裂降低和基因組不穩(wěn)定性與ATAD5 表達(dá)降低相關(guān)[6-7]。屬于激酶家族的ATM主要參與DNA鏈斷裂后的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)因子Chk、DNA修復(fù)和凋亡等生物學(xué)反應(yīng)[8]。已有研究證實(shí),在人單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中,炎癥因子基因的表達(dá)可以直接由p53和ATM依賴機(jī)制誘導(dǎo)[9],而T細(xì)胞激活引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)以及T細(xì)胞受體和CD40誘導(dǎo)的抗體類別轉(zhuǎn)換重組過程中的DNA雙鏈斷裂損傷均需要ATM調(diào)控[10-11],且在基因毒應(yīng)激后,NF-κB靶基因參與炎癥的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)需要ATM對p65的Ser547磷酸化[12]。EHMT2是一種賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶,其主要功能是使組蛋白H3的賴氨酸二甲基化 (H3K9me2)[13]。EHMT2是T細(xì)胞、先天淋巴細(xì)胞和Th細(xì)胞發(fā)育、分化以及功能調(diào)節(jié)的中心控制點(diǎn)。如EHMT2通過介導(dǎo)依賴H3K9me2的T細(xì)胞反應(yīng)參與T細(xì)胞功能調(diào)節(jié),或通過H3K9me2限制轉(zhuǎn)錄因子和共激活劑對特定基因位點(diǎn)的可及性,調(diào)控幼稚T細(xì)胞,抑制基因表達(dá),而且可抑制病毒感染期間記憶T細(xì)胞CD25和CD27的表達(dá)[14-15]。UTP18是核糖體亞基加工組的重要組成部分。已有研究發(fā)現(xiàn)在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌細(xì)胞和HEK 293T細(xì)胞中觀察到內(nèi)源性UTP18免疫應(yīng)答[16]。PTPN14是調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程的信號分子,包括細(xì)胞生長、分化、有絲分裂周期和致癌轉(zhuǎn)化。PTPN14作為腫瘤抑制因子,其低表達(dá)與較短的總生存率相關(guān)[17]。但新研究表明,PTPN14通過介導(dǎo)血管內(nèi)皮鈣粘著蛋白的磷酸化也參與了炎癥的調(diào)節(jié)[18]。

綜上所述,本研究基于基因集富集分析鑒定出與ESCC顯著相關(guān)的免疫基因,同時(shí)分析免疫基因與腫瘤患者臨床特征的相關(guān)性,并進(jìn)一步通過腫瘤免疫浸潤分析發(fā)現(xiàn)與核心基因顯著相關(guān)的免疫細(xì)胞,可為ESCC免疫相關(guān)研究提供一定的理論依據(jù)。