劉海云,石淼婷,駱欣怡,孫敏燕,徐晨曦,陳鯤翰,王曉敏,舒任庚

(江西中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院,南昌 330004)

2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)是一種嚴重影響人類健康、以高血糖和胰島素抵抗為特征的慢性代謝性疾病[1]。胰島β細胞的功能受損和胰島素抵抗是T2DM重要病理生理過程。青錢柳廣泛分布我國的江西、湖北、湖南等省,是我國特有的單種屬植物[2]。近年來國家衛(wèi)生健康委員會公布青錢柳葉為新資源食品。青錢柳葉具有良好的改善糖脂代謝紊亂等作用而引起更多的關注。青錢柳葉中含有豐富的多糖、黃酮、皂苷等多種次生代謝產(chǎn)物[3-4],其中青錢柳多糖[Cyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinskaja polysaccharide,CPP]具有良好的降血糖和降血脂等藥理作用[5-6]。研究表明,CPP主要通過促進葡萄糖利用、保護胰島細胞、調節(jié)胰島素信號通路等多種途徑糾正糖脂代謝紊亂[7],但其對于調節(jié)血糖關鍵環(huán)節(jié)——葡萄糖攝取的機制尚不清楚。本課題組前期研究結果表明,CPP顯著上調骨骼肌胰島素受體底物1(insulin receptor substrates 1 ,IRS-1)、磷酯酰肌醇3 激酶(phosphorylated phosphoinositide-3-kinase,PI3K )、絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶1(phosphorylated serine-threonine kinase 1,Akt1)、葡萄糖轉運蛋白4(glucose transporter 4 ,GLUT4)mRNA表達水平[8]。GLUT4是細胞膜上葡萄糖轉運的重要載體蛋白,在胰島素刺激下細胞質內GLUT4的囊泡移動到細胞膜上,與葡萄糖結合,促進葡萄糖攝取來調節(jié)血糖。基于CPP對胰島抵抗重要器官——胰島和肝臟的影響尚不清楚,本實驗進一步觀察其對肝臟和胰島PI3K、Akt1、GLUT4蛋白表達及GLUT4轉位的影響,為CPP防治2型糖尿病提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥物 取青錢柳茶葉(湖南省張家界高山怡韻茶葉有限公司,由江西中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室張壽文教授鑒定)5 kg,熱水提取之后,得到青錢柳水提物。將水提物經(jīng)過濾、濃縮與醇沉后過濾去除殘渣,得到濾液,再將濾液減壓濃縮至2 L,加入4倍體積的無水乙醇,使其含醇量達80%,放4 ℃靜置過夜。以2 250×g轉速將醇沉過濾液離心15 min,得到多糖沉淀物,再將多糖沉淀物依次用無水乙醇、丙酮及乙醚洗滌并干燥,即得CPP粗品[9]。

1.2動物 無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級雄性SD大鼠,4周齡,體質量(180±20) g,購買于湖南斯萊克斯實驗動物有限公司,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2021-0004,動物合格證號:01754718,動物倫理批準號:JZLLSC2021-0065。于江西中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院實驗動物中心飼養(yǎng),晝夜各12 h,飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～25 ℃。

1.3試劑 鏈脲佐菌素(美國Simga公司,批號:S0130);血糖儀試紙條(瑞士羅氏活力公司,批號:0514418);總膽固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triacylglycerol,TG)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白( low density lipoprotein,LDL)(中生北控生物科技股份有限公司,批號:20210724、20210307、20210227、20210120);膽固醇、膽酸鈉(美國BBI公司,批號:D421BA0028、E305BA0043);蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin,HE)染液(珠海貝索生物技術有限公司,批號:717112);p-PI3K、p-Akt1、GLUT4一抗(北京博奧森生物技術有限公司,批號:bs-6417R、bs-60670R、bs-0384R);SP二步法試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB )顯色盒(北京中杉金橋生物試劑公司,批號:ZS-1619、ZS-154、PV-9001和K133319D);免疫熒光試劑(武漢賽維爾生物公司,批號:GB22303)。

1.4儀器 高速低溫離心機(德國Simga公司,SIGMA3-18K);多功能酶標儀(美國MD公司,SpectraMaxM3);電熱恒溫水浴鍋(濟南東吉儀器有限公司,HH.S21-4);紫外分光光度計(尤尼柯儀器有限公司,UV-2102型);切片機、烤片機(德國徠卡公司,EG1150H、RM2255);顯微鏡(德國徠卡公司,DM2500);全自動數(shù)字切片掃描與應用系統(tǒng)(美國羅氏公司,iScan Coreo);Image J(美國冷泉公司)。

1.5方法

1.5.1造模、分組及給藥 SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后,給予高脂高糖乳劑灌胃,劑量1 mL·kg-1,連續(xù)灌胃8周后,禁食12 h,腹腔1次性注射鏈脲佐菌素35 mg·kg-1,72 h后取內眥靜脈血測其空腹血糖值,血糖>11.1 mmol·L-1大鼠則為造模成功[10]。大鼠隨機分為5組,即正常對照組、模型對照組、CPP小劑量組、CPP大劑量組、二甲雙胍組,每組9只。正常對照組和模型對照組均灌胃給予0.9%氯化鈉溶液1 mL·kg-1;CPP小劑量組給予CPP 5 g·kg-1;CPP大劑量組給予CPP 10 g· kg-1;二甲雙胍組給予鹽酸二甲雙胍0.25 g·kg-1,均灌胃給予,體積均為1 mL·kg-1,灌胃8周。

1.5.2大鼠的一般情況及體質量變化 觀察各組大鼠的行為學改變、活動度、皮膚毛發(fā)、飲食、飲水情況等一般狀況;分別于實驗前和每周末稱取大鼠體質量各1次,連續(xù)8周。

1.5.3血糖和血脂測定 待大鼠禁食12 h后,予10%水合氯醛麻醉眼球取血,靜置30 min,2 250×g轉速離心20 min,吸取血清,測定空腹血糖值和TC、TG、LDL、HDL含量,嚴格參照說明書操作。

1.5.4HE染色法觀察肝臟和胰島病理形態(tài)的改變 切取胰腺的胰尾部分和肝左葉,用甲醛固定后,石蠟包埋切片,進行常規(guī)HE染色,觀察胰島和肝臟組織學變化,嚴格參照說明書操作。

1.5.5免疫組化法檢測胰島p-PI3K、p-Akt1和GLUT4表達 將胰腺石蠟切片,厚度約3 μm。60 ℃烘烤2 h,待蠟融化后趁熱放入二甲苯、梯度乙醇進行透明和脫水,用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saling,PBS)清洗后,加入3%過氧化氫(H2O2)在室溫下孵育,放入高壓鍋進行熱修復抗原5 min。滴加p-PI3K、p-Akt1、GLUT4抗體分別按照1：300、1：200、1：200比例稀釋,正常對照組滴加PBS。4 ℃過夜,DAB顯色,在光鏡下觀察組織變?yōu)闇\棕色即停止反應。全自動數(shù)字切片掃描與應用系統(tǒng)采集圖片,并選取200倍視野/張切片5個,用Image Pro Plus 6.0版軟件進行圖像分析。

1.5.6免疫熒光觀察GLUT4轉位 胰腺和肝臟組織石蠟切片脫蠟至水后,切片浸沒pH值6.0檸檬酸緩沖液中,放入微波爐內進行抗原熱修復,自然冷卻,用PBS緩沖液晃動洗滌,切片稍甩干,加入自發(fā)熒光淬滅劑5 min,流水沖洗10 min,滴加牛血清清蛋白(albumin from bovine serum,BSA)封閉孵育30 min,滴加1：200比例稀釋的GLUT4一抗后放入濕盒,4 ℃孵育過夜。連續(xù)3次PBS洗滌后,滴加二抗后,避光室溫孵育50 min,PBS晃動洗滌,滴加4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染液避光室溫孵育10 min。連續(xù)3次,每次PBS晃動洗滌5 min,抗熒光淬滅封片劑封片,并熒光顯微鏡下觀察轉位情況并采集圖像[11]。采用Image J軟件分析圖像,得出灰度值后,計算相對熒光強度值=給藥組平均強度/正常對照組平均強度。

2 結果

2.1各組大鼠的基本狀態(tài)及體質量情況 正常對照組大鼠實驗期精神狀況良好,活動敏銳,毛色光亮。模型對照組大鼠懶惰厭動,毛色發(fā)黃并易脫毛,消瘦,多食,多飲和多尿。CPP組和二甲雙胍組大鼠的“三多一少”癥狀有所改善。造模前各組間大鼠體質量均差異無統(tǒng)計學意義。造模成功后,與正常對照組比較,其余各組大鼠體質量明顯升高(P<0.05)。給藥8周后,CPP大劑量組和二甲雙胍組大鼠的體質量均有所增加,與模型對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),結果見表1。

表1 5組大鼠不同時間的體質量變化

2.2各組大鼠空腹血糖測定結果 造模前各組間大鼠空腹血糖無明顯差異。造模后大鼠血糖明顯升高,與正常對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。給藥8周后,與模型對照組比較,CPP大劑量組和二甲雙胍組大鼠空腹血糖明顯下降(P<0.05)。CPP小劑量組大鼠空腹血糖雖下降,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),結果見表2。

表2 5組大鼠不同時間的空腹血糖

Tab.2 Fasting glucose in five groups of rats at different times

表2 5組大鼠不同時間的空腹血糖

組別造模前給藥前 給藥8周正常對照組5.5±0.74.8±0.7①4.7±0.6①模型對照組5.0±0.621.0±6.116.6±6.4二甲雙胍組4.8±0.618.0±7.17.6±3.2②CPP 小劑量組4.6±0.518.8±7.312.6±5.8 大劑量組4.9±0.820.3±7.49.8±4.4②

①與模型對照組比較 ,t=5.061、10.321,P<0.01;②與模型對照組比較 ,t=2.142、4.325,P<0.05。

①Compared with model control group,t=5.061,10.321,P<0.01;②Compared with model control group,t=2.142,4.325,P<0.05.

2.3各組大鼠血脂的測定結果 與正常對照組比較,模型對照組LDL升高,HDL下降(P<0.01),提示模型對照組大鼠的血脂紊亂。與模型對照組比較,CPP大、小劑量組和二甲雙胍組HDL升高(P<0.05),TC、TG和LDL有所下降,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),且二甲雙胍的效果優(yōu)于CPP,提示CPP主要是提高HDL水平。見表3。

表3 5組大鼠血脂的測定結果

Tab.3 Determination of serum lipid in five groups of rats

表3 5組大鼠血脂的測定結果

組別TCTGLDLHDL正常對照組1.49±0.220.64±0.220.12±0.060.71±0.06模型對照組2.38±0.761.36±0.210.35±0.14①0.39±0.20①二甲雙胍組1.62±0.370.75±0.190.14±0.070.52±0.18②CPP 小劑量組1.77±0.120.91±0.600.26±0.190.57±0.23② 大劑量組2.23±0.410.88±0.910.30±0.060.55±0.25②

①與正常對照組比較,t=6.752、9.874,P<0.01;②與模型對照組比較, t=2.245～3.391,P<0.05。

①Compared with normal control group,t=6.752,9.874,P<0.01;②Compared with model control group,t=2.245-3.391,P<0.05.

2.4各組大鼠胰島和肝臟形態(tài)改變 正常對照組胰島細胞數(shù)量多,排列有序,呈橢圓形或圓形,邊界清晰。模型對照組大鼠的胰島受損,形狀不規(guī)則,邊界模糊,細胞排列紊亂,纖維組織增多,有炎癥細胞浸潤。CPP大、小劑量組與二甲雙胍組的胰島相對完整,形狀接近橢圓形,邊界相對清晰;細胞排列有序,僅有少數(shù)胰島細胞變性或壞死及少量炎癥細胞浸潤。

正常對照組大鼠肝小葉完整,肝細胞大小正常,細胞呈圓形,細胞核居中,以中央靜脈為中心呈放射狀。模型對照組大鼠有較多肝細胞發(fā)生脂肪變性,部分肝細胞出現(xiàn)核固縮。給藥組肝細胞脂肪變性明顯好轉,肝小葉結構較完整。見圖1。

A.正常對照組;B.模型對照組;C.CPP小劑量組;D.CPP大劑量組;E.二甲雙胍組。

2.5各組大鼠胰島細胞p-PI3K、p-Akt1、GLUT4蛋白表達 p-PI3K和p-Akt1免疫組織化學陽性表達均位于細胞質,GLUT4陽性表達主要位于細胞質和細胞核。與正常對照組比較,模型對照組胰島的p-PI3K、p-Akt1、GLUT4蛋白平均灰度值明顯降低(P<0.05或P<0.01)。與模型對照組比較,CPP大劑量組和二甲雙胍組胰島p-PI3K和p-Akt1、GLUT4陽性表達明顯升高(P<0.05或P<0.01),提示CPP能提高胰島p-PI3K、p-Akt1、GLUT4蛋白表達。見圖2。

2.6各組大鼠胰島細胞和肝細胞GLUT4移位 GLUT4熒光染色在胰島細胞和肝細胞的細胞質和細胞膜均表達,顯示紅色熒光。GLUT4是細胞膜上一種轉運蛋白,如細胞質也有表達,提示細胞質的GLUT4囊泡可能向細胞膜發(fā)生轉位[11]。在模型對照組中,胰島細胞和肝細胞的細胞質和細胞膜GLUT4染色較少。與模型對照組比較,CPP給藥組的細胞質和細胞膜的GLUT4熒光強度增加。這表明CPP可促進胰島細胞和肝細胞GLUT4囊泡向細胞膜上轉位。見圖3。

3 討論

中醫(yī)“消渴”癥涵蓋糖尿病,病由熱生,熱極成毒,因而熱毒是“消渴病”重要病因。清熱解毒中藥對糖尿病具有療效好、不良反應少等優(yōu)勢[12]。青錢柳是我國特有的單種屬植物,其枝葉味甘甜,具有清熱消腫、鎮(zhèn)痛的功效,是一種能降血糖的茶葉。近年來多項研究均發(fā)現(xiàn)CPP具有良好的降低血糖、改善血脂作用[13-14]。機體葡萄糖和脂質代謝的紊亂是引起胰島抵抗關鍵環(huán)節(jié)。彭曉娟等[15]的研究表明,CPP顯著減輕非酒精性脂肪性肝病/T2DM大鼠代謝紊亂、肝臟脂肪變性及炎癥反應,能夠抑制肝臟及脂肪組織過氧化物酶體增殖物激活受體-γ和增強子結合蛋白mRNA 的表達量,提示CPP可通過肝胰島素抵抗降低血糖。本課題組前期研究表明CPP具有降低血糖、胰島素水平和胰島素抗體的作用。本研究進一步觀察其對肝臟和胰島形態(tài)影響及GLUT4轉位影響,結果表明,給予CPP 8周后,模型大鼠一般癥狀有所好轉,血糖下降和HDL上升,且CPP大劑量組的胰島近似橢圓形,結構較完整,邊界較清晰,炎癥細胞和纖維組織明顯減少,損傷的胰島有所修復,且脂質變性的肝細胞數(shù)量也明顯減少,進一步提示CPP大劑量組具有良好的降血糖與降血脂藥理作用,能改善高脂和鏈脲佐菌素造成的肝臟和胰島損傷。本結果與相關文獻報道相似[16]。

肝臟、骨骼肌和脂肪組織等外周胰島素抵抗是胰島素抵抗重要組成部分,胰島素通過與肝臟、骨骼肌等器官細胞膜胰島受體結合激活下游PI3K/Akt1促進肝和肌肉等細胞中葡萄糖轉運蛋白從細胞質轉移到細胞膜上促進葡萄糖攝取。胰島素PI3K/Akt信號轉導通路蛋白的缺失和異?？蓪е翯LUT4的表達減少、易位受阻及含GLUT4囊泡不能與細胞膜融合、GLUT4活性降低等,導致胰島素抵抗的發(fā)生[17]。

GLUT4是一種膜蛋白,主要在肝臟、骨骼肌和脂肪細胞表達,主要儲藏在細胞內囊泡,是外周組織轉運葡萄糖的重要載體蛋白[18]。胰島素與肝臟、骨骼肌、脂肪等各種靶細胞膜胰島素受體相結合后,IRS磷酸化,激活下游PI3K/Akt1通路,促發(fā)GLUT4囊泡以胞吐形式向細胞表面轉位,靶組織對葡萄糖攝取增加。研究表明PI3K既可通過肝臟、骨骼肌和胰島等組織細胞上調跨膜轉運蛋白GLUT4表達及轉位,同時也能夠激活下游線粒體的功能,調節(jié)生物體內的代謝和能量平衡[19]。因而PI3K是GLUT4轉位必需的信號分子之一。本實驗結果提示,CPP組能夠升高T2MD大鼠胰島細胞p-PI3K、p-Akt1、GLUT4蛋白表達。免疫熒光結果可直觀觀察到模型對照組的胰島細胞和肝細胞GLUT4免疫熒光強度明顯減弱,而CPP組胰島細胞和肝細胞的細胞質和細胞膜GLUT4熒光強度升高。該結果提示,CPP可能促進肝臟和胰島細胞質內GLUT4向細胞膜轉位,且胰島p-PI3K、p-Akt1、GLUT4蛋白表達增多,提高肝細胞和胰島攝取葡萄糖,從而降低血糖水平。

綜上所述,本研究表明CPP具有降低T2MD模型大鼠血糖和升高HDL水平的藥理作用,減輕高糖對胰島和肝臟的損傷,其機制可能是通過上調胰島p-PI3K、p-Akt1、GLUT4含量,并促進胰島細胞和肝細胞GLUT4轉位。但是其以胰島和肝臟哪個為主導,還是兩者的協(xié)同作用,有待進一步深入研究。