王婭琳，魏 琳，李 娜，張 騫，常 濤，羅崇亮，趙 娜，徐世曉

（1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所, 青海 西寧 810008；2.中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049）

鹽堿土是地球上廣泛分布的一種土壤類型，對(duì)全球農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展存在巨大影響。我國鹽堿土地資源廣泛，各類鹽漬土面積約有9.91 × 107hm2[1]。其中西北六省(區(qū))鹽堿地面積占全國的69.03%，是我國內(nèi)陸鹽堿土的集中分布區(qū)，土壤鹽漬化問題突出[2]。且由于人類活動(dòng)和氣候變化的影響，鹽堿土壤的面積還在不斷增加和擴(kuò)大。鹽脅迫是鹽堿地中植物重要的逆境因子之一，自然界中鹽堿脅迫主要以NaCl、Na2SO4和NaHCO3等鈉鹽為主[3]。土壤鹽漬化會(huì)使鹽堿離子在土壤表層聚集，從而對(duì)植株細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的毒害，導(dǎo)致植物生長緩慢、生長矮小、產(chǎn)量低，嚴(yán)重制約農(nóng)牧業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展[4-5]。且高濃度鹽脅迫會(huì)通過離子毒害和植物組織缺水致使植物死亡[6]。同時(shí)，土壤鹽漬化后土壤結(jié)構(gòu)組成發(fā)生變化，出現(xiàn)土壤退化和水土流失等問題，導(dǎo)致植物更不易定植，進(jìn)一步導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境惡化[7]。因此鹽堿地合理開發(fā)利用和改良是眾多學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。

選育耐鹽堿植物是利用和改良鹽堿地土地最科學(xué)的手段之一[8]。研究表明，草本植物是鹽堿地生態(tài)植被重要組成成分，有些可作為先鋒植物或建群種，對(duì)鹽堿地生態(tài)修復(fù)有重要作用[9-10]。牧草作為西北地區(qū)重要的生產(chǎn)資料，是草食家畜的優(yōu)良飼料[11]。且與多數(shù)農(nóng)作物相比，牧草受土壤和水分的影響相對(duì)較小，有較強(qiáng)的抗逆能力，是發(fā)展耐鹽植物、利用鹽漬化土壤較好的材料[7,9-10]。同時(shí)有研究表明，種子萌發(fā)期是植物生活史中最脆弱的階段，對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)最敏感，可以直接影響牧草的生長速度和經(jīng)濟(jì)效益[12-14]。因此種子萌發(fā)期的耐鹽能力大小對(duì)植物是否能適應(yīng)鹽堿環(huán)境起決定作用。

青海省受其特殊的地理位置和氣候環(huán)境影響，是我國鹽堿化土地分布的主要地區(qū)之一，農(nóng)牧業(yè)生態(tài)系統(tǒng)十分脆弱[15]。且該省是我國重要的畜牧業(yè)生產(chǎn)基地，畜牧業(yè)生產(chǎn)是牧民賴以生存的經(jīng)濟(jì)來源[16]。對(duì)該區(qū)域鹽堿地合理開發(fā)利用有利于提高民生福祉，維護(hù)生態(tài)穩(wěn)定，減小天然草地放牧壓力。因此選擇適應(yīng)該地區(qū)鹽堿地生長的優(yōu)良耐鹽堿牧草尤為重要。本研究以青海省3 種鄉(xiāng)土禾本科牧草垂穗披堿草(Elymus nutans)、老芒麥(E.sibiricus)和短芒披堿草(E.breviaristatus)為研究對(duì)象，分別研究其在NaCl 和Na2SO4兩種鹽脅迫下的耐鹽能力，以期為篩選適合鹽堿地生長的優(yōu)良牧草品種提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試種子購于青海凱瑞公司，為商用種。所用鈉鹽為分析純NaCl 和Na2SO4。挑選顆粒飽滿、大小一致且無病蟲害的垂穗披堿草、老芒麥和短芒披堿草種子，使用0.5% 高錳酸鉀溶液消毒3 min 后，再用無菌蒸餾水沖洗干凈，室溫晾干后，保存于信封中備用，作為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

分別設(shè)置50、100、150、200 和250 mmol·L-1的NaCl 鹽溶液和40、80、120、160 和200 mmol·L-1的Na2SO4鹽溶液，以蒸餾水作為對(duì)照(CK)。再將種子置于鋪有兩層濾紙、直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中均勻放置50 粒種子。分別加入上述配比的不同濃度的NaCl 和Na2SO4鹽溶液10 mL 至濾紙飽和，以后每天添加蒸餾水補(bǔ)充損失水分，使濾紙一直處于飽和狀態(tài)。每個(gè)處理設(shè)置4 次重復(fù)，置于人工氣候箱中。人工氣候箱白天溫度為25 ℃，夜晚溫度為18 ℃，每天光照12 h，黑暗12 h，光照強(qiáng)度12 000 lx，濕度為60%[17]。每天記錄萌發(fā)情況，以種子連續(xù)3 d 不再萌發(fā)為末次計(jì)數(shù)時(shí)間。種子發(fā)芽以胚根出現(xiàn)為標(biāo)準(zhǔn)[18]，以第3 天的發(fā)芽種子數(shù)計(jì)算發(fā)芽勢(shì)，并在第10 天使用游標(biāo)卡尺測(cè)量3 種牧草種子胚根長和胚芽長[19]。每個(gè)處理隨機(jī)測(cè)量15 株，不足15 株的則全部測(cè)量。

1.3 測(cè)定指標(biāo)

發(fā)芽率(germination rate, GR) = 各處理發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù) × 100%；

發(fā)芽勢(shì)(germination potential, GP) = 處理第3 天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù) × 100%； ∑

發(fā)芽指數(shù)(germination index，GI) = (Gt/Dt)。式中：Gt為相應(yīng)天數(shù)種子的發(fā)芽數(shù)，Dt為萌發(fā)相應(yīng)天數(shù)；

活力指數(shù)(vigor index, VI) = 發(fā)芽指數(shù)/胚芽長。

相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)、相對(duì)活力指數(shù)、相對(duì)胚芽長及相對(duì)胚根長計(jì)算為處理組和對(duì)照組比值的百分?jǐn)?shù)。相對(duì)發(fā)芽勢(shì)為處理組第5 天發(fā)芽種子數(shù)和對(duì)照組發(fā)芽率比值的百分?jǐn)?shù)。芽根比和相對(duì)鹽害率計(jì)算公式：

芽根比 = 胚芽長/胚根長 × 100%；

相對(duì)鹽害率 = (對(duì)照組發(fā)芽率 - 處理組發(fā)芽率)/對(duì)照組發(fā)芽率 × 100%[20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理及耐受性綜合評(píng)價(jià)

利用Excel 2010 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，SPSS 24.0 進(jìn)行單因素方差和線性回歸分析，GraphPad Prism 9.0作圖。利用種子相對(duì)發(fā)芽率與相應(yīng)鹽溶液濃度建立回歸關(guān)系，計(jì)算耐鹽適宜濃度(相對(duì)發(fā)芽率為75%)、耐鹽半致死濃度(相對(duì)發(fā)芽率為50%) 和耐鹽極限濃度(相對(duì)發(fā)芽率為25%)[21]。同時(shí)，采用隸屬函數(shù)法對(duì)不同鹽濃度下3 種牧草種子的耐鹽能力進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[22]，公式如下：

式中：j= 1, 2, 3,…,n。 μ(Xj)為各指標(biāo)隸屬函數(shù)值，Xj為某指標(biāo)測(cè)定值，Xmin為某指標(biāo)測(cè)定值的最小值，Xmax為某指標(biāo)測(cè)定值的最大值。得到各項(xiàng)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值后求其平均值。平均值越大說明耐鹽性越大，平均值越小說明耐鹽性越小。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對(duì)牧草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的影響

在兩種鹽脅迫處理下，3 種牧草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)隨鹽濃度升高呈現(xiàn)不同程度的下降(圖1)。與對(duì)照相比，垂穗披堿草和短芒披堿草鹽脅迫下發(fā)芽率表現(xiàn)趨勢(shì)相似。在小于100 mmol·L-1NaCl 和80 mmol·L-1Na2SO4處理下，發(fā)芽率均沒有明顯下降(P＞ 0.05)，大于100 mmol·L-1NaCl 和80 mmol·L-1Na2SO4處理下，發(fā)芽率顯著降低(P＜ 0.05)。在250 mmol·L-1NaCl 和200 mmol·L-1Na2SO4濃度時(shí)，垂穗披堿草發(fā)芽率下降至37.00% 和11.00%，短芒披堿草發(fā)芽率下降至15.50% 和20.00%。老芒麥種子在40 mmol·L-1Na2SO4和50 mmol·L-1NaCl 處理下，發(fā)芽率無明顯變化，在150 mmol·L-1NaCl 和80 mmol·L-1Na2SO4處理下，發(fā)芽率顯著下降(P＜ 0.05)。在250 mmol·L-1NaCl 和200 mmol·L-1Na2SO4濃度時(shí)，種子發(fā)芽率下降至18.50%和7.00%。3 種牧草種子發(fā)芽勢(shì)隨鹽濃度升高呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)。其中，在250 mmol·L-1NaCl 和200 mmol·L-1Na2SO4濃度時(shí)，垂穗披堿草發(fā)芽勢(shì)下降至7.50% 和1.00%，短芒披堿草發(fā)芽勢(shì)下降至2.00% 和7.00%，老芒麥發(fā)芽勢(shì)下降至5.00%和0。

圖1 Na2SO4 和NaCl 鹽溶液對(duì)3 種牧草發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的影響Figure 1 Germination rate and potential of three herbage species under different concentration of Na2SO4 and NaCl

2.2 鹽脅迫對(duì)牧草種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響

種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)是衡量種子活力的重要指標(biāo)。3 種牧草種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)隨NaCl 和Na2SO4鹽濃度增加表現(xiàn)出不同的下降趨勢(shì)(圖2)。與 對(duì) 照 相 比，在250 mmol·L-1NaCl 和200 mmol·L-1Na2SO4濃度下，垂穗披堿草發(fā)芽指數(shù)降低至對(duì)照值的26.50%和8.15%；短芒披堿草發(fā)芽指數(shù)降低至20.12% 和13.22%；老芒麥發(fā)芽指數(shù)降低至13.10%和4.59%。3 種種子活力指數(shù)在200 mmol·L-1Na2SO4和250 mmol·L-1NaCl 濃度時(shí)均下降為0。

圖2 Na2SO4 和NaCl 鹽溶液對(duì)3 種牧草發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響Figure 2 Germination and vitality indices of three herbage species under different concentrations of Na2SO4 and NaCl

2.3 鹽脅迫對(duì)牧草種子胚芽和胚根及芽根比的影響

3 種牧草種子胚芽長和胚根長均隨兩種鹽濃度增高而逐漸減小(表1)。垂穗披堿草在160 mmol·L-1Na2SO4和250 mmol·L-1NaCl 時(shí)胚芽不再長出；200 mmol·L-1Na2SO4和250 mmol·L-1NaCl 時(shí)，胚根長下降至對(duì)照的2.16% 和4.92%。短芒披堿草在200 mmol·L-1NaCl 和160 mmol·L-1Na2SO4時(shí) 胚 芽 不 再長出；200 mmol·L-1Na2SO4時(shí)，胚根也失去活力，250 mmol·L-1NaCl 時(shí)胚根下降至對(duì)照的2.00%。老芒 麥 在120 mmol·L-1Na2SO4和200 mmol·L-1NaCl時(shí)胚芽不再長出；胚根在200 mmol·L-1Na2SO4時(shí)不再長出，250 mmol·L-1NaCl 時(shí)根長下降至對(duì)照的1.99%。且隨鹽濃度增加，3 種牧草芽根比均呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，說明鹽脅迫對(duì)3 種牧草種子的毒害先作用于胚根生長后先作用于胚芽生長。

表1 NaCl 和Na2SO4 處理對(duì)3 種牧草種子胚芽、胚根和芽根比的影響Table 1 Effects of NaCl and Na2SO4 treatments on seed germ, radicle, and shoot root ratio of three herbage species

2.4 鹽脅迫對(duì)牧草種子相對(duì)鹽害率的影響

NaCl 和Na2SO4對(duì)3 種牧草種子鹽害率隨鹽濃度增加呈上升趨勢(shì)(圖3)。在Na2SO4脅迫下，3 種牧草種子相對(duì)鹽害率大小為老芒麥 ＞ 垂穗披堿草 ＞短芒披堿草。其中，垂穗披堿草種子在80～120 mmol·L-1時(shí)相對(duì)鹽害率增加最大，短芒披堿草則在160～200 mmol·L-1時(shí)相對(duì)鹽害率增加最大，老芒麥在40～80 mmol·L-1時(shí)相對(duì)鹽害率增加最大。250 mmol·L-1NaCl 脅迫下，3 種牧草種子相對(duì)鹽害率大小為短芒披堿草 ＞ 老芒麥 ＞ 垂穗披堿草。其中，垂穗披堿草和老芒麥種子在150～200 mmol·L-1時(shí)相對(duì)鹽害率增加最大，短芒披堿草則在200～250 mmol·L-1時(shí)相對(duì)鹽害率增加最大。

圖3 NaCl 和Na2SO4 溶液對(duì)3 種牧草種子相對(duì)鹽害率影響Figure 3 Effects of NaCl and Na2SO4 solutions on relative salt damage rates of three herbage seeds

根據(jù)鹽濃度與相對(duì)發(fā)芽率間的關(guān)系建立回歸直線方程式(表2)。計(jì)算得到，垂穗披堿草對(duì)Na2SO4的耐鹽適宜濃度、半致死濃度和臨界濃度分別為48.93、94.80 和140.66 mmol·L-1，對(duì)NaCl 的耐鹽適宜濃度、半致死濃度和臨界濃度分別為135.15、207.59 和280.03 mmol·L-1。短芒披堿草對(duì)Na2SO4的耐鹽適宜濃度、半致死濃度和臨界濃度分別為110.45、157.96和205.46 mmol·L-1，對(duì)NaCl 的耐鹽適宜濃度、半致死濃度和臨界濃度分別為139.11、195.56和252.02 mmol·L-1。老芒麥對(duì)Na2SO4的耐鹽適宜濃度、半致死濃度和臨界濃度分別為55.26、105.24和155.21 mmol·L-1，對(duì)NaCl 的耐鹽適宜濃度、半致死濃度和臨界濃度分別為118.89、177.18 和235.46 mmol·L-1。

表2 3 種牧草種子對(duì)NaCl 和Na2SO4 溶液的耐受濃度Table 2 Tolerated concentrations of NaCl and Na2SO4 solutions for three herbage seeds

2.5 鹽脅迫下3 種牧草種子耐鹽能力綜合評(píng)價(jià)

使用隸屬函數(shù)法計(jì)算NaCl 和Na2SO4脅迫下3 種牧草的8 個(gè)萌發(fā)指標(biāo)，進(jìn)而計(jì)算各隸屬函數(shù)的平均值，結(jié)果(表3) 顯示，Na2SO4脅迫下3 種牧草耐鹽排名為短芒披堿草 ＞ 垂穗披堿草 ＞ 老芒麥；NaCl 脅迫下，3 種牧草耐鹽排名為垂穗披堿草 ＞ 短芒披堿草 ＞ 老芒麥。3 種牧草中垂穗披堿草和短芒披堿草綜合耐鹽指數(shù)相對(duì)較高。

表3 3 種牧草各指標(biāo)隸屬函數(shù)值和耐鹽性綜合評(píng)價(jià)Table 3 Membership function values and comprehensive evaluation of salt tolerance in three herbage species

3 討論

發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)是評(píng)價(jià)種子發(fā)芽能力的重要指標(biāo)，能評(píng)價(jià)植物對(duì)鹽脅迫的耐受能力[21]。發(fā)芽率能在一定程度上體現(xiàn)耐鹽性的差異，耐鹽性越高發(fā)芽率越高。發(fā)芽勢(shì)反映了種子一定時(shí)間內(nèi)的萌發(fā)速度，發(fā)芽勢(shì)高低可反映鹽脅迫對(duì)種子萌發(fā)速度的影響[23]。本研究中，3 種牧草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均隨鹽濃度增高呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，與李京蓉等[17]結(jié)果一致，說明鹽濃度過高抑制種子萌發(fā)，降低了3 種牧草的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)。研究表明鹽脅迫達(dá)到種子耐鹽臨界濃度時(shí)，會(huì)導(dǎo)致植物產(chǎn)生離子毒害和滲透壓失衡，一方面細(xì)胞外溶液環(huán)境的滲透壓會(huì)抑制種子對(duì)水分的汲取和利用，干擾細(xì)胞的正常生命活動(dòng)，另一方面無機(jī)鹽離子進(jìn)入細(xì)胞，改變細(xì)胞膜的滲透調(diào)節(jié)，進(jìn)一步擾亂細(xì)胞內(nèi)部的代謝活動(dòng)，使種子呼吸作用無法正常進(jìn)行，從而導(dǎo)致種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)大幅降低，甚至死亡[24-25]。本研究中在200 mmol·L-1Na2SO4和250 mmol·L-1NaCl 時(shí)，種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)處于較低狀態(tài)，說明此濃度時(shí)種子已受鹽離子毒害，無法完成正常生命活動(dòng)。

發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)反映種子的萌發(fā)速度、整齊度和幼苗生長潛力，同等鹽脅迫下，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)越高，耐鹽性越好[26]。在本研究中，200 mmol·L-1Na2SO4和250 mmol·L-1NaCl 時(shí)，3 種牧草種子活力指數(shù)均已為0，雖部分種子萌發(fā)了胚根，但均未長出胚芽。可能原因是種子在萌發(fā)吸水過程中，種子內(nèi)的可水溶物質(zhì)含量較高，種皮滲透勢(shì)降低，有利于從環(huán)境中吸水，短時(shí)間內(nèi)啟動(dòng)了生理活動(dòng)，使種子萌發(fā)的標(biāo)志物胚根出現(xiàn)，但由于脅迫作用抑制其生長，從而導(dǎo)致活力指數(shù)顯著降低[27]。且本研究中，Na2SO4鹽脅迫對(duì)3 種種子的鹽脅迫能力大于NaCl 鹽脅迫，原因可能為Na2SO4鹽溶液的離子濃度高于NaCl 鹽溶液，造成了更大的滲透脅迫，進(jìn)一步抑制了種子萌發(fā)生長[28-29]。

胚芽、胚根和芽根比能反映植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)，是植物幼苗感受到鹽脅迫后最直觀的變化。本研究中，與對(duì)照相比，幼苗胚芽和胚根在鹽脅迫下均表現(xiàn)出明顯下降趨勢(shì)，與季波等[26]研究結(jié)果相似，說明鹽脅迫抑制了3 種牧草胚根、胚芽的伸長。且從胚芽長度看，垂穗披堿草胚芽在250 mmol·L-1NaCl 時(shí)不再長出，短芒披堿草和老芒麥胚芽200 mmol·L-1NaCl 時(shí)不再長出，說明垂穗披堿草對(duì)NaCl鹽脅迫的耐受性較高。老芒麥胚芽在120 mmol·L-1Na2SO4時(shí)不再長出，說明老芒麥對(duì)Na2SO4鹽脅迫最敏感。且3 種種子芽根比隨鹽脅迫濃度增加均呈現(xiàn)先增加后減小趨勢(shì)。這說明在較低鹽脅迫下，植物胚根受到毒害大于胚芽，生長速度更慢，后隨鹽濃度增加，種子活力下降較大，植物僅能長出較短胚根，不能再抽出胚芽，這與胡卉芳等[30]研究結(jié)果相同。同時(shí)，羅小燕等[31]研究也表明鹽脅迫主要通過阻礙植物根系吸收水分的方式影響植物生長發(fā)育，與本研究結(jié)果一致。

利用單一指標(biāo)鑒定植物的抗鹽性強(qiáng)弱具有片面性，需采用多指標(biāo)相結(jié)合的方法對(duì)植物的耐鹽性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。本研究中采用8 個(gè)指標(biāo)進(jìn)行耐鹽堿能力綜合評(píng)價(jià)，通過隸屬函數(shù)和主成分權(quán)重相結(jié)合法計(jì)算植物耐鹽堿能力，發(fā)現(xiàn)Na2SO4脅迫下3 種植物耐鹽堿能力由強(qiáng)至弱依次為短芒披堿草 ＞ 垂穗披堿草 ＞ 老芒麥，NaCl 脅迫下3 種植物耐鹽堿能力為垂穗披堿草 ＞ 短芒披堿草 ＞ 老芒麥。通過對(duì)植物半致死濃度的計(jì)算也發(fā)現(xiàn)NaCl 脅迫下垂穗披堿草半致死濃度最高，為207.59 mmol·L-1，Na2SO4脅迫下短芒披堿草半致死濃度最高，為157.96 mmol·L-1。結(jié)果說明，NaCl 脅迫下垂穗披堿草較其他牧草耐鹽堿水平高，Na2SO4脅迫下短芒披堿草耐鹽堿水平高。值得注意的是，垂穗披堿草對(duì)NaCl 脅迫的耐受度較高，但對(duì)Na2SO4脅迫耐受度較低，這可能跟植物自身對(duì)離子的敏感度有關(guān)[32]。短芒披堿草在兩種鹽脅迫下較穩(wěn)定，且均表現(xiàn)出較高的耐鹽性，是較為理想的鹽堿地種植候選牧草。

4 結(jié)論

通過對(duì)3 種牧草兩種鹽脅迫下發(fā)芽指標(biāo)的分析發(fā)現(xiàn)，3 種牧草發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均隨鹽濃度增加而降低，但由于種子特性表現(xiàn)出不同的下降速度。隨鹽濃度增加，3 種牧草胚芽和胚根生長受到顯著抑制，芽根比呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，說明植物胚根對(duì)鹽脅迫更為敏感。通過耐鹽度評(píng)價(jià)計(jì)算，垂穗披堿草對(duì)NaCl 脅迫的耐受度最高，而短芒披堿草對(duì)兩種鹽脅迫有較穩(wěn)定的表現(xiàn)和較高的耐受能力，可作為鹽堿地種植的候選牧草。