陳騰飛 張玲梅 王施瑋 周 曉 任園園 陳 波 施小偉 葉成堅 鄭文賀

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003）

膿毒癥是極其復(fù)雜、極具威脅又難于治療的臨床病癥，每年在全世界范圍內(nèi)有數(shù)百萬的患者受其威脅，雖然Surviving Sepsis Campaign 指南有效地指導(dǎo)了臨床診療［1］，但其死亡率仍可高達30%以上［2］。參附注射液是“回陽法”的代表方劑，已發(fā)現(xiàn)其具有一定抗炎作用［3-4］，被推薦用于嚴重膿毒癥的免疫調(diào)理治療［5］，而具體療效機制亟待進一步探索。NOD 樣受體家族中含有pyrin 結(jié)構(gòu)域的蛋白3（NLRP3）的激活、半胱天冬氨酸酶-1 前體（Pro-Caspase-1）自剪切及gasdermin D（GSDMD）N 端結(jié)構(gòu)域（GSDMD-N）釋放和成孔效應(yīng)所造成的細胞焦亡是膿毒癥早期過度炎癥反應(yīng)的重要機制［6-8］。本研究將基于上述信號通路，探討參附注射液治療膿毒癥的可能機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞及藥物 J774A.1 細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司（貨號：CL-0370）。參附注射液為華潤三九（雅安）藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑 重組Anti-GSDMD 抗體（貨號：ab209845）、重組Anti-pro Caspase-1+p10+p12 抗體（貨號：ab179515）購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司。Mouse IL-1 beta ELISA Kit 購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司（貨號：KE10003）。L-乳酸脫氫酶（L-LDH）活性檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司（貨號：BC0685）。尼日利亞菌素（Nigericin）為InvivoGen 公司產(chǎn)品（貨號：tlrl-nig）。脂多糖（LPS）來源于大腸桿菌0111：B4，購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司（貨號：L4391）。

1.3 造模與分組 取對數(shù)生長期細胞用于試驗。將上述細胞分為5 組：空白組在細胞接種后，常規(guī)培養(yǎng)細胞；模型組細胞在LPS 100 ng/mL 提前處理目的細胞4 h 之后加入10 μmol/L Nigericin 處理2 h；通過MTT 試驗確定參附注射液對該細胞的適宜干預(yù)濃度，并在此基礎(chǔ)上設(shè)置低、中和高3 個濃度梯度，參附注射液組細胞在模型組的基礎(chǔ)上加入上述相應(yīng)濃度的參附注射液進行共刺激。白光視野下的焦亡細胞觀察通過倒置顯微鏡在室溫下進行。

1.4 細胞毒性試驗 采用LDH釋放法進行，結(jié)果以可催化產(chǎn)生的丙酮酸水平來表示。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡試驗（WB） WB 法檢測細胞及上清液中Pro-Caspase-1、Caspase-1、GSDMD 及GSDMD-N蛋白水平，內(nèi)參為3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）。采用Image J 進行圖像分析，以目的蛋白與GAPDH 的灰度比值表示蛋白表達水平。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） ELISA 法檢測細胞培養(yǎng)上清中白細胞介素-1β（IL-1β）水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 統(tǒng)計軟件。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示。多組計量資料間的比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 參附注射液不同濃度下J774A.1 細胞的存活情況 見表1。10 μL/mL 及更低濃度的參附注射液對J774A.1 細胞的存活未造成影響，故設(shè)置低、中及高劑量參附注射液組藥物濃度分別為2.5、5、10 μL/mL。

表1 參附注射液不同濃度下J774A.1細胞的存活率（±s）

表1 參附注射液不同濃度下J774A.1細胞的存活率（±s）

注：與0 μL/mL參附注射液比較，*P ＜0.05。

濃度（μL/mL）40.0 20.0 10.0 5.0 2.5 0細胞存活率（%）0.51±0.10*0.75±0.03*0.98±0.03 1.05±0.01 0.94±0.04 0.97±0.04 n666666

2.2 各組倒置顯微鏡下的細胞形態(tài)比較 見圖1?？捎^察到模型組J774A.1 細胞先后經(jīng)LPS 及Nigericin 刺激后，細胞呈膨脹球形改變，且較多細胞出現(xiàn)胞膜破裂。經(jīng)不同濃度參附注射液干預(yù)后，上述改變有緩解，以高劑量參附注射液組緩解程度最為明顯。

圖1 各組細胞在倒置顯微鏡下的形態(tài)觀察（400倍）

2.3 各組細胞的存活情況比較 見表2。模型組細胞上清液出檢出的丙酮酸水平明顯高于空白組（P＜0.05），而經(jīng)低、中和高劑量參附注射液干預(yù)后則出現(xiàn)不同程度的下降（P＜0.05）。

表2 各組細胞存活情況比較（μmol/L，±s）

注：與空白組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05。下同。

組別空白組模型組低劑量參附注射液組中劑量參附注射液組高劑量參附注射液組丙酮酸水平1.17±0.05 1.30±0.07*1.23±0.08△1.17±0.04△1.09±0.05△n66666

2.4 各組Pro-Caspase-1、Caspase-1、GSDMD 及GSD-MD-N 蛋白表達比較 見圖2、表3。模型組GSDMDN 及Caspase-1 水平均較空白組明顯升高（P＜0.05），而經(jīng)參附注射液干預(yù)后，兩者均出現(xiàn)不同水平的表達量下降（P＜0.05）。

圖2 各組細胞Pro-Caspase-1、Caspase-1、GSDMD及GSDMD-N蛋白表達

表3 各組細胞Caspase-1及GSDMD-N蛋白水平比較（±s）

表3 各組細胞Caspase-1及GSDMD-N蛋白水平比較（±s）

組別空白組模型組低劑量參附注射液組中劑量參附注射液組高劑量參附注射液組n66666 Caspase-1 0.09±0.03 0.17±0.04*0.02±0.01△0.13±0.07 0.04±0.02△GSDMD-N 0.03±0.01 0.19±0.04*0.14±0.05△0.10±0.05△0.06±0.02△

2.5 各組細胞培養(yǎng)上清中IL-1β 水平比較 見表4。模型組細胞上清液中IL-1β 水平較空白組顯著增高（P＜0.05），經(jīng)參附注射液干預(yù)后則出現(xiàn)明顯下降（P＜0.05）。

表4 各組細胞上清液中IL-1β水平比較（pg/mL，±s）

表4 各組細胞上清液中IL-1β水平比較（pg/mL，±s）

組別空白組模型組低劑量參附注射液組中劑量參附注射液組高劑量參附注射液組n66666 IL-1β 7.40±2.58 16.36±1.82*6.63±0.70△4.70±2.03△2.98±1.05△

3 討 論

NLR 家族中含有pyrin 結(jié)構(gòu)域3 的NLRP3 是一類研究最為廣泛深入的炎癥小體，各類PAMPs如病毒RNA、微生物毒素和細菌表面成分以及DAMPs 如尿酸晶體、ATP、鋁佐劑和β-淀粉樣肽等均能造成其激活。激活的NLRP3募集Pro-Caspase-1，并引起其自剪切。激活的Caspase-1 可促使IL-1β 和IL-18 的成熟，并剪切GSDMD，釋放其N 端結(jié)構(gòu)域GSDMD-N。該結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)移到細胞膜并形成孔，介導(dǎo)包括上述炎癥細胞因子在內(nèi)的細胞內(nèi)容物釋放，最終造成細胞焦亡［6-8］，進而幫助宿主有效抵抗病原菌、病毒等的侵擾。然而由于失調(diào)而過量激活的炎癥小體又會導(dǎo)致膿毒癥的發(fā)生。

膿毒癥可歸屬于中醫(yī)學(xué)“外感熱病”“溫病”“溫毒”及外科“疔瘡走黃”“疽毒內(nèi)陷”等范疇，膿毒性休克和多器官功能衰竭則可歸屬于中醫(yī)學(xué)“脫證”“厥證”范疇。目前隨著中醫(yī)對膿毒癥證候特征的認識逐步深入展開，對病因病機的論述主要集中在正氣不足、腑氣不通、瘀熱毒邪內(nèi)蘊、濁毒等方面?；颊叨嗑貌◇w虛，正氣虧虛，陰陽失和，外來之邪則乘虛而入，致機體臟腑功能失調(diào)，氣血津液輸布失常，最終形成了膿毒癥，因此正氣不足是本病的基本病機，是膿毒癥的病理基礎(chǔ)。正如《素問·刺法論》所云“正氣存內(nèi)，邪不可干”“邪之所湊，其氣必虛”，而“少火生氣、壯火食氣”，重癥膿毒癥的高熱階段往往出現(xiàn)陽氣耗散，陽損及陰，陰陽俱損，最終元氣頹敗，發(fā)展為厥、脫之證。施治應(yīng)以“益氣溫陽，扶正固本”為要。

參附注射液是“回陽法”的代表方劑。方中附子首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，有“回陽救逆第一品藥”之稱。人參亦首見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，素有“虛勞內(nèi)傷第一要藥”之稱。附子與人參配伍可達到上助心陽，下補腎陽，中健脾氣，氣陽同救，溫而兼潤，補而能固的功效?！夺t(yī)宗金鑒》有言“補后天之氣無如人參，補先天之氣無如附子”。二藥相須，人參得附子瞬息化氣于烏有之鄉(xiāng)；附子得人參，頃刻生陽于命門之內(nèi)。臨床研究證實其可減少膿毒性休克患者對血管加壓藥的需求以及重癥病房的住院時間［9］，并可通過降低白細胞介素-6（IL-6）、C 反應(yīng)蛋白（CPR）、HMGB-1 和vWF 水平，延長燒傷膿毒癥患者的平均存活時間［10］，已被《膿毒癥中西醫(yī)結(jié)合診治專家共識》［5］推薦用于嚴重膿毒癥的免疫調(diào)理治療。根據(jù)現(xiàn)有的藥理學(xué)研究，認為附子的主要有效成分是以烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿為代表的C19型二萜生物堿。目前研究已發(fā)現(xiàn)其存在一定的抗炎活性，可能通過調(diào)節(jié)了趨化因子介導(dǎo)的白細胞趨化而發(fā)揮作用［11］；其亦可與其他藥物配伍下協(xié)同抑制IL-1β、IL-6、IFN-γ 等促炎因子的過表達［12］。人參皂苷是人參主要的活性化合物，根據(jù)其羥基及配基雙鍵的位置主要分為原人參二醇和原人參三醇。原人參二醇包括人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、Rh2和Rs1，原人參三醇包括Re、Rf、Rg1、Rg2 和Rh1。已有研究發(fā)現(xiàn)這些組分在抑制炎癥方面的作用，如Rh2 可干預(yù)p38 MAPK、c-Jun 及核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）通路，抑制巨噬細胞釋放腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6 和IL-1β［13］，其亦可通過干預(yù)TGF-β1/Smad通路抑制促炎因子的釋放［14］。另外，人參還富含人參多糖，其亦可通過干預(yù)NF-κB 通路，明顯抑制TNF-α 和IL-6 過度表達［15］。本研究證實參附注射液能減輕細胞焦亡所導(dǎo)致的細胞腫脹及胞膜破裂改變，相應(yīng)向胞外釋放的LDH 水平也有明顯降低。進一步對GSDMD-N 及Caspase-1 蛋白表達水平分析發(fā)現(xiàn)，參附注射液可抑制Pro-Caspase-1 自剪切及后續(xù)對GSDMD 的剪切過程，初步確定了其抑制細胞焦亡的靶點。

綜上，參附注射液能抑制NLR3P/Caspase1/GSDMD 介導(dǎo)的J774A.1 細胞焦亡改變，減輕其細胞腫脹及胞膜破裂，相應(yīng)減少其向胞外釋放的LDH 水平。其機制可能與其抑制了Pro-Caspase-1自剪切，繼而導(dǎo)致具有細胞成孔效應(yīng)的GSDMD-N釋放減少有關(guān)。