李進(jìn)良,胡雙飛,李沛波,吳灝,彭維,蘇薇薇,王永剛,孫維廣

(1.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心/廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510275;2.廣州白云山星群<藥業(yè)>股份有限公司,廣東 廣州 510288)

干眼癥(dry eye disease,DED)是一種常見的眼部疾病,其發(fā)病率逐年上升,嚴(yán)重影響了患者的正常生活和工作[1]。目前,雖然有多種治療干眼癥的方法[2],但病因復(fù)雜,如藥物依賴、病情反復(fù)等問題,治療效果并不理想[3]。因此,亟須尋找或開發(fā)一種更加安全有效的治療方法。中藥用于治療眼部疾病歷史已久,在治療眼部等疾病中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。夏桑菊(Xiasangju)是一種傳統(tǒng)的中藥復(fù)方,常用于治療目赤腫痛、風(fēng)熱感冒、流感等[4],因其治療目赤腫痛效果較好,提示其具有治療干眼癥潛力。然而,夏桑菊用于治療干眼癥鮮有報(bào)道。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,夏桑菊具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多種生物學(xué)效應(yīng)[5]。夏桑菊中的桑葉、野菊花能有效改善瞼板腺功能障礙引起的干眼癥,且治療過程簡(jiǎn)單易行、效果良好,但其作用機(jī)制尚未明確[6]。目前,淚液滲透壓升高引發(fā)的眼表炎癥已被認(rèn)為是干眼癥的標(biāo)志[7-9]?；诖?本研究采用人角膜上皮細(xì)胞,通過構(gòu)建高滲透壓模型探究夏桑菊對(duì)人角膜上皮細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制,以期為干眼癥的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞HCE-T人角膜上皮細(xì)胞系(富衡生物,FH1239)。

1.1.2 主要試劑夏桑菊浸膏[廣州白云山星群(藥業(yè))股份有限公司,批號(hào)：B220301];HCE-T專用培養(yǎng)基(富衡生物,FH-HCET);N-乙酰-L-半胱氨酸(蘭博利德,YXBG01-25G);氯化鈉(Sigma-Aldrich,S3014-500g)、白介素-18、白介素-6、白介素-1β檢測(cè)試劑盒均購于云克隆Cloud-clone;EZ-press RNA Purification Kit(蘇州英澤生物醫(yī)藥科技有限公司,B0004D);迷迭香酸(中國食品藥品檢定研究院,批號(hào)：111871-202007)等。

1.1.3 主要儀器設(shè)備色譜柱：依利特 Hypersil ODS(4.6 mm×250 mm,5 μm);HERAcell vios 160 CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司);HT840超凈工作臺(tái)(蘇州凈化安泰技術(shù)有限公司);CytoFLEX流式細(xì)胞分析儀(CytoFLEX,Beckman);HWS24型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司);酶標(biāo)儀(美國Bio Tek)、LC480實(shí)時(shí)熒光定量384孔PCR儀(瑞士Roche公司);Virit960梯度PCR儀(美國Applied Biosystems公司);Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國Dionex公司)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件色譜柱：C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),檢測(cè)波長(zhǎng)329 nm,流速0.9 mL·min-1,柱溫30 ℃,進(jìn)樣體積 10 μL,按照《中國藥典》夏桑菊顆粒[10]中的流動(dòng)相條件梯度洗脫。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)HCE-T細(xì)胞每2 d換液1次,細(xì)胞生長(zhǎng)至近融合狀態(tài)時(shí),用胰蛋白酶消化細(xì)胞并傳代。培養(yǎng)條件為HCE-T專用完全培養(yǎng)基,置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)。

1.2.3 MTS法檢測(cè)細(xì)胞活力細(xì)胞用不同濃度(30、50、70、90、110、130 mmol·L-1)NaCl分別模擬(350、400、450、500、550、600 mOsm·L-1)滲透壓及用不同夏桑菊生藥量濃度處理人角膜上皮細(xì)胞24 h,更換培養(yǎng)基,加入20 μL MTS孵育1～4 h后,采用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)490 nm處吸光度(optical density,OD)值,按公式計(jì)算得各組的細(xì)胞活力：細(xì)胞活力=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.2.4 研究夏桑菊的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)分設(shè)不同組,采用600 mOsm·L-1(130 mmol·L-1NaCl)滲透壓造模并同時(shí)給藥,MTS檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.2.5 夏桑菊的保護(hù)作用機(jī)制研究

1.2.5.1 抗氧化作用使用2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)探針檢測(cè) ROS。將細(xì)胞以2×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在6孔板中,按照各自的處理培養(yǎng)24 h。在37 ℃下與10 μmol·L-1DCFH-DA 探針染料孵育30 min后,用PBS洗滌細(xì)胞兩次,流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)。

1.2.5.2 抗炎作用①ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中炎癥因子IL-1β、IL-6及IL-18的質(zhì)量濃度：細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組并做相應(yīng)處理。每組處理24 h。檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清。

②實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)夏桑菊浸膏對(duì)高滲誘導(dǎo)下人角膜上皮細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)：細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組并做相應(yīng)處理,處理24 h。提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后于-20 ℃條件下保存。采用實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀擴(kuò)增各組cDNA目的基因。IL-1β上游引物：CACGATGCACCTGTACGAT CA,下游引物：AGACATCACCAAGCTTTTTTGCT;GAPDH上游引物：ATGTTCGTCATGGGTGTGAA,下游引物：GGTGCTAAGCAGTTGGTGGT。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 8.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),結(jié)果采用單因素方差分析,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 含量測(cè)定按上述色譜條件,將樣品進(jìn)行處理和進(jìn)樣分析,每份樣品平行進(jìn)兩針,測(cè)定迷迭香酸峰面積,計(jì)算夏桑菊浸膏中迷迭香酸的含量,含量測(cè)定結(jié)果表明,檢測(cè)得到迷迭香酸含量為6 mg·g-1,高于《中國藥典》規(guī)定夏桑菊顆粒中迷迭香酸含量。

圖1 迷迭香酸對(duì)照品(A)和夏桑菊浸膏(B)的HPLC色譜圖

2.2 不同滲透壓對(duì)人角膜上皮細(xì)胞活力的影響MTS結(jié)果如圖2所示,不同滲透壓處理24 h,350、400、450 mOsm·L-1滲透壓對(duì)人角膜上皮細(xì)胞的活性影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,500～550 mOsm·L-1滲透壓降低了人角膜上皮細(xì)胞活性,分別降至70%和61%(P<0.01)。600 mOsm·L-1滲透壓可明顯降低其活性,低于37.6%(P<0.01)。

圖2 不同滲透壓對(duì)人角膜上皮細(xì)胞細(xì)胞活性的影響(N=3) 注：與正常對(duì)照組比較,#P< 0.05,##P < 0.01。

2.3 夏桑菊對(duì)人角膜上皮細(xì)胞活性的影響采用不同濃度夏桑菊處理24 h對(duì)人角膜上皮細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)見圖3,與正常對(duì)照組相比,夏桑菊濃度≥10 mg·mL-1時(shí),對(duì)細(xì)胞活性具有顯著抑制作用;夏桑菊濃度<10 mg·mL-1,對(duì)細(xì)胞活性無顯著性影響。以10 mg·mL-1為最大濃度,設(shè)置多個(gè)濃度評(píng)價(jià)夏桑菊的藥效。由“2.2”項(xiàng)下結(jié)果可知,600 mOsm·L-1滲透壓能夠有效降低人角膜上皮細(xì)胞活力,因此后續(xù)選用600 mOsm·L-1滲透壓處理,以探究夏桑菊對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用;低于或等于450 mOsm·L-1滲透壓時(shí),對(duì)人角膜上皮細(xì)胞的活性影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,故選用450 mOsm·L-1滲透壓造模探究夏桑菊浸膏對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制及遷移能力。

圖3 不同濃度夏桑菊浸膏對(duì)人角膜上皮細(xì)胞活性的影響結(jié)果(N=3) 注：與正常對(duì)照組比較,#P<0.05,##P<0.01。

2.4 夏桑菊浸膏對(duì)高滲誘導(dǎo)的人角膜上皮細(xì)胞的保護(hù)作用將人角膜上皮細(xì)胞在600 mOsm·L-1滲透壓培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后,與正常對(duì)照組相比,600 mOsm·L-1組的細(xì)胞活力由100%降至43.5%(P<0.01)。與600 mOsm·L-1比較,0.625 mg·mL-1和1.25 mg·mL-1夏桑菊可有效提高人角膜上皮細(xì)胞活性,細(xì)胞活性由模型組的45%提高到67.3%和64.9%(P<0.01),如圖4所示。表明夏桑菊浸膏對(duì)高滲透壓所致的細(xì)胞活性降低具有抑制作用。

圖4 夏桑菊浸膏對(duì)高滲誘導(dǎo)的人角膜上皮細(xì)胞的保護(hù)作用的影響(N=3) 注：與正常對(duì)照組比較,##P<0.01;與600 mOsm·L-1組比較,*P<0.05,**P<0.01。

2.5 夏桑菊浸膏對(duì)高滲誘導(dǎo)下人角膜上皮細(xì)胞ROS水平的影響 HCE-T細(xì)胞在高滲誘導(dǎo)下,細(xì)胞系統(tǒng)中的氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)之間動(dòng)態(tài)平衡失調(diào),導(dǎo)致氧化損傷。由圖5可知,與正常對(duì)照組相比,450 mOsm·L-1組 ROS的生成明顯增多(P<0.01);與450 mOsm·L-1組相比,450 mOsm·L-1+625 μg·mL-1組和450 mOsm·L-1+1.25 mg·mL-1組細(xì)胞ROS的生成明顯減少 (P<0.01)。說明夏桑菊能夠有效抑制高滲誘導(dǎo)下人角膜上皮細(xì)胞 ROS水平升高,在一定程度上緩解高滲所致的氧化應(yīng)激。

圖5 夏桑菊浸膏對(duì)高滲誘導(dǎo)的人角膜上皮細(xì)胞的ROS水平影響(N=3) 注：與正常對(duì)照組比較,##P<0.01;與450 mOsm·L-1組比較,**P<0.01。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)夏桑菊浸膏對(duì)高滲誘導(dǎo)下人角膜上皮細(xì)胞IL-1β及Caspase-1基因的表達(dá)PCR結(jié)果顯示,450 mOsm·L-1組IL-1β、Caspase-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比升高 (P<0.01);與450 mOsm·L-1相比,450 mOsm·L-1+1.25 mg·mL-1組 mRNA的相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05),如圖6所示。研究表明夏桑菊能夠有效抑制高滲誘導(dǎo)下人角膜上皮細(xì)胞中IL-1β及Caspase-1基因表達(dá)。

圖6 夏桑菊浸膏對(duì)高滲誘導(dǎo)下人角膜上皮細(xì)胞IL-1β、Caspase-1基因的表達(dá)的影響(N=3) 注：與正常對(duì)照組比較,##P<0.01;與450 mOsm·L-1組比較,*P<0.05,**P<0.01。

2.7 夏桑菊浸膏對(duì)高滲誘導(dǎo)下人角膜上皮細(xì)胞分泌IL-6、IL-18、IL-1β水平的影響高滲誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中 ROS 的產(chǎn)生,被認(rèn)為是啟動(dòng) NLRP3 炎性體激活的關(guān)鍵觸發(fā)因素[9],隨著 NLRP3 炎性體激活,各種炎癥因子分泌水平易受影響,根據(jù)圖7分析,各組IL-6、IL-18、IL-1β的蛋白濃度差具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組相比,450 mOsm·L-1組中的IL-6、IL-18、IL-1β蛋白濃度明顯升高(P<0.01);與450 mOsm·L-1組相比,450 mOsm·L-1+625 μg·mL-1組IL-6、IL-18、IL-1β的蛋白濃度明顯降低(P<0.01)。表明夏桑菊浸膏有效抑制了細(xì)胞中炎癥因子IL-6、IL-18、IL-1β的蛋白分泌。

圖7 夏桑菊浸膏對(duì)高滲誘導(dǎo)下人角膜上皮細(xì)胞分泌IL-1β、IL-18、IL-6水平的影響(N=3) 注：與正常對(duì)照組比較,##P<0.01;與450 mOsm·L-1比較,*P<0.05,**P<0.01。

3 討論

在干眼癥發(fā)生過程中,角膜上皮細(xì)胞是最先受到水分流失影響的細(xì)胞,同時(shí)是眼中唯一暴露在外界環(huán)境中的細(xì)胞,處于高滲環(huán)境下,角膜上皮細(xì)胞易凋亡和屏障功能受損[11-15]。研究表明,夏桑菊浸膏中的多種活性成分,例如黃酮類、有機(jī)酸類化合物等,通過調(diào)節(jié)多種炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)通路來發(fā)揮藥效作用[16]。具備眼部疾病保健、預(yù)防、醫(yī)療潛力[17]。陳安蘭等[18]將夏枯草及野菊花開發(fā)成雷菊滴眼液治療結(jié)膜炎,發(fā)現(xiàn)具有明顯的治療效果。魚俊杰等[19]采用中藥菊花、桑葉等制成清明眼藥水,治療電光性眼炎310例,總有效率99.97%。臨床結(jié)果表明,清明眼藥水是一種療效好、療程短的中藥滴眼劑。本研究通過構(gòu)建高滲透壓模型,確定合適的夏桑菊的給藥濃度,給予高滲環(huán)境下人角膜上皮細(xì)胞合適夏桑菊浸膏的干預(yù),發(fā)現(xiàn)夏桑菊可以抑制高滲誘導(dǎo)的人角膜上皮細(xì)胞活性下降,證明了夏桑菊保護(hù)人角膜上皮細(xì)胞免受高滲誘導(dǎo)的損傷的作用。初步揭示夏桑菊在治療高滲引起的干眼癥中具有藥效作用。

高滲引起的眼表炎癥已被認(rèn)為是該病的特征之一[20]。本研究采用NaCl模擬高滲條件體外誘導(dǎo)干眼癥模型。在高滲刺激細(xì)胞后,其活性氧顯著增加,夏桑菊處理細(xì)胞后,ROS顯著減少,證明夏桑菊可以抑制人角膜上皮細(xì)胞中高滲誘導(dǎo)的ROS的增加。此外,高滲誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-18的分泌水平增加,表明響應(yīng)高滲應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧不僅會(huì)引發(fā)眼表氧化應(yīng)激,將引發(fā)涉及炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致各種促炎細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生。而給予夏桑菊干預(yù)后顯著降低了炎癥因子的表達(dá)。體內(nèi)研究顯示,在干眼癥患者的淚液和眼表中觀察到NLRP3炎癥小體的上調(diào)。高滲應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧可以激活小鼠干眼癥模型中的NLRP3炎性體[16]。進(jìn)一步體外研究表明,活性氧誘導(dǎo)的NLRP3激活通過Caspase-1激活導(dǎo)致IL-1β分泌增加,突出了ROS-NLRP3-IL-1β 信號(hào)軸在干眼癥進(jìn)展過程中的重要作用[21]。以上表明,夏桑菊可能通過抑制ROS-NLRP3-IL-1β信號(hào)通路來減輕干眼癥的炎癥反應(yīng)。

綜上所述,夏桑菊浸膏可以保護(hù)高滲誘導(dǎo)的人角膜上皮細(xì)胞的損傷,這種保護(hù)作用可能與其抑制ROS升高及炎癥因子的表達(dá)有關(guān),后續(xù)需對(duì)夏桑菊在干眼癥治療中的作用機(jī)制進(jìn)一步深入研究,為其臨床應(yīng)用提供更加可靠的依據(jù)。綜上,夏桑菊在干眼癥的治療中具有一定的潛力和應(yīng)用價(jià)值。