顧明慧, 范瑞洋, 王道晨, 顧 晨, 于明浩, 魏萬紅, 楊生妹

(揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 江蘇揚(yáng)州 225009)

纖維素是自然界中數(shù)量最多的可再生資源之一[1]。由于其特殊的晶體結(jié)構(gòu)在自然條件下難以被水解,僅少量纖維素能被降解利用[2]。纖維素酶是一組能將纖維素分子降解為纖維二糖和葡萄糖等小分子物質(zhì)的復(fù)合酶[3]。利用微生物產(chǎn)纖維素酶降解纖維素是一種較有效的纖維素處理方法,該方法溫和、產(chǎn)物產(chǎn)率高、無二次污染[4]。

目前已從土壤[5]、堆肥[6]、反芻動(dòng)物胃腸道[7]等環(huán)境中分離出多株高產(chǎn)纖維素酶的菌株,但對(duì)布氏田鼠胃腸道纖維素分解菌的研究尚未見報(bào)道。布氏田鼠是主要分布在我國內(nèi)蒙古草原上的一種植食性哺乳動(dòng)物[8-9], 每只每天可食用約40 g鮮草[10], 是典型的盲腸發(fā)酵動(dòng)物。Ye等[11]研究表明布氏田鼠盲腸內(nèi)微生物數(shù)量和種類復(fù)雜多樣。鑒此,本研究以布氏田鼠盲腸內(nèi)容物為材料,通過剛果紅染色初篩、酶活力測(cè)定復(fù)篩等方法篩選出高酶活性纖維素分解菌株,并對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定,研究其酶學(xué)特性,為纖維素資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源

布氏田鼠捕捉于內(nèi)蒙古錫林浩特草原,飼養(yǎng)于揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房,并建立繁殖系。隨機(jī)選100日齡健康布氏田鼠雌雄各2只作為研究對(duì)象。布氏田鼠饑餓12 h后行安樂死,隨后解剖取出盲腸,放入無菌EP管中,于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

蛋白胨、酵母提取物(濟(jì)南金華峰輝生物科技公司); MgSO4·7H2O、NaCl、K2HPO4、瓊脂(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司); 剛果紅、3,5-二硝基水楊酸(DNS) (上海生工生物工程公司)。

1.1.3 主要儀器及設(shè)備

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司); 電熱恒溫干燥箱(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠); 酶標(biāo)儀(上海精密科學(xué)儀器公司); 高壓蒸汽滅菌鍋(日本Tomy公司); 電子天平(上海精密科學(xué)儀器公司); PCR 擴(kuò)增儀(德國Christ-Elektronik公司); 凝膠成像分析儀(BIO-RAD Laboratories-Segrate)(美國Bio-Rad公司); 恒溫培養(yǎng)搖床(上海?，攲?shí)驗(yàn)儀器公司)等。

1.2 培養(yǎng)基與配方

1) 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)篩選培養(yǎng)基: CMC-Na 10 g, K2HPO41.5 g, 蛋白胨5 g, 酵母粉5 g, NaCl 5 g, MgSO4·7H2O 0.2 g, 瓊脂16 g, 純化水1 000 mL。

2) LB培養(yǎng)基: 蛋白胨10 g, 酵母5 g, NaCl 10 g, 純化水1 000 mL。

3) 發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基: 蛋白胨10 g, 酵母5 g, NaCl 10 g, CMC-Na 10 g, 純化水1 000 mL。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 纖維素分解菌初篩

在超凈工作臺(tái)上將盲腸內(nèi)容物擠入50 mL無菌生理鹽水中,在搖床上震蕩30 min。搖完后菌液混勻,梯度稀釋至10-5級(jí),取各濃度稀釋腸液0.2 mL, 分別涂布于CMC-Na平板上, 于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h, 向培養(yǎng)皿中加入適量的1 mg·mL-1剛果紅溶液,染色1 h后棄去染液,再加入適量1 mol·L-1NaCl溶液洗滌[12], 并測(cè)量水解圈的大小。

1.3.2 纖維素分解菌復(fù)篩

將初篩菌株接種到液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24 h后離心取上清液,即為粗酶液。以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn),采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑法測(cè)定纖維素酶活性, CMC-Na在纖維素酶的作用下,水解產(chǎn)生纖維二糖和葡萄糖等還原糖,還原糖能將DNS中的硝基還原成棕紅色氨基化合物,在波長540 nm處測(cè)定吸光度D值,吸光度與酶活性呈正比。纖維素酶活性定義: 以每毫升粗酶液每分鐘產(chǎn)生1 mg葡萄糖所需的酶量作為1個(gè)酶活性單位(U·mL-1)。

1.3.3 菌株鑒定

1) 形態(tài)學(xué)鑒定: 經(jīng)初篩、復(fù)篩出1株纖維素酶活性最高的菌株T1, 觀察菌落的形態(tài)特征,并通過革蘭染色觀察菌體的染色特征[13]。

2) 分子生物學(xué)鑒定: 菌株T1培養(yǎng)過夜后用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取DNA, PCR反應(yīng)的引物為細(xì)菌通用引物, PCR反應(yīng)體系體積為25 μL, 反應(yīng)條件見文獻(xiàn)[14]。測(cè)序由上海生工生物工程公司完成。將測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中用BLAST比對(duì)獲得相似性高的序列。利用MEGA6.0 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,根據(jù)菌株間的親緣關(guān)系確定菌株的種屬。

1.3.4 菌株生長曲線

將菌株T1接種到LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至D值為1.0, 得種子液。按1%種子液接入50 mL新配制的LB培養(yǎng)基中, 37 ℃搖床培養(yǎng), 每4 h用酶標(biāo)儀測(cè)1次D600 nm值, 直至60 h。

1.3.5 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,依次優(yōu)化培養(yǎng)基中碳源(高粱、玉米、大豆、羧甲基纖維素鈉、水稻、小麥)、氮源(蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、明膠)的種類和濃度(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)以及接種量(1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%), 37 ℃、160 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h, 將菌液在上述確定的最佳條件下進(jìn)行纖維素酶活性測(cè)定,試驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取平均值。

1.3.6 纖維素酶的酶學(xué)特性研究

1) 酶反應(yīng)最適pH: 將1.0% CMC-Na的底物分別溶于pH 3.0～7.0的緩沖液中, 40 ℃反應(yīng)30 min 后測(cè)定該纖維素酶活性,試驗(yàn)重復(fù)3次, 結(jié)果取平均值,最終確定纖維素酶反應(yīng)的最適pH值。

2) 酶的酸堿穩(wěn)定性: 將pH 4.0～8.0 緩沖液與粗酶液按同等量混勻, 40 ℃水浴中保溫1 h, 在最適pH反應(yīng)條件下,測(cè)定相對(duì)纖維素酶活性,試驗(yàn)重復(fù)3次, 結(jié)果取平均值,并評(píng)價(jià)酶的酸堿穩(wěn)定性。

3) 酶反應(yīng)最適溫度: 將粗酶液分別置于不同溫度(40、50、60、70和80 ℃)反應(yīng)30 min, 測(cè)定該纖維素酶活性,試驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取平均值,最終確定纖維素酶反應(yīng)的最適溫度。

4) 酶的熱穩(wěn)定性: 將粗酶液分別在30、40、50、60和70 ℃的水浴中保溫1 h, 在最適溫度和最適pH下測(cè)定相對(duì)酶活性,試驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取平均值,并評(píng)價(jià)該酶的熱穩(wěn)定性。

5) 最適反應(yīng)時(shí)間: 將粗酶液與CMC-Na底物在最適 pH及最適溫度條件下分別反應(yīng)10、20、30、40和50 min, 測(cè)定不同反應(yīng)時(shí)間纖維素酶活性,確定纖維素酶反應(yīng)的最佳時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素分解菌株的篩選

在CMC-Na選擇培養(yǎng)基上挑取菌落形態(tài)不同的菌株共8株,經(jīng)純化培養(yǎng),利用剛果紅染色后菌落周圍可見清晰的透明水解圈。將獲得的菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩,篩選結(jié)果見表1。最終選取纖維素酶活性最高的菌株T1用于酶學(xué)特性及產(chǎn)酶條件的探究。

表1 纖維素分解菌的分離篩選Tab.1 Isolation and screening of cellulose-degrading bacteria

2.2 菌株T1的鑒定

2.2.1 菌株T1的形態(tài)學(xué)鑒定

經(jīng)觀察表明,菌株T1在固體培養(yǎng)基上扁平,表面褶皺,形成灰白色不透明的菌落(圖1.A)。經(jīng)革蘭染色,菌株T1為革蘭陽性桿狀菌,有芽孢(圖1.B)。

圖1 菌株T1的菌落形態(tài)特征及革蘭染色Fig.1 Morphology characteristic and gram staining of strain T1

2.2.2 菌株T1的分子生物學(xué)鑒定

測(cè)序結(jié)果顯示,該纖維素分解菌T1的16SrDNA基因序列長為1 374 bp左右。序列同源性分析顯示,菌株T1與芽孢桿菌屬細(xì)菌的16SrDNA序列相似性在99%以上。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示,該菌株與Bacillussubtilisstrain親緣關(guān)系最近(圖2)。綜合該菌株的菌落形態(tài)、生化特性和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果,確定獲得的纖維素分解菌T1為枯草芽孢桿菌。

圖2 菌株T1 16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹*Fig.2 Phylogenetic tree of strain T1 based on its 16S rDNA gene* 圖中節(jié)點(diǎn)處數(shù)字為重復(fù)1 000次所得到的自舉百分率。* The number at the node shows the bootstrap percentage obtained by repeating 1 000 times in the figure.

2.3 菌株T1的生長特性

圖3為菌株T1的生長規(guī)律,當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)4～16 h時(shí),菌株 T1 進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期; 培養(yǎng)16～48 h 時(shí)處于緩慢增長期; 40 h 后進(jìn)入衰退期。

圖3 菌株T1的生長曲線Fig.3 Growth curve of strain T1

2.4 菌株T1產(chǎn)纖維素酶條件的初步優(yōu)化

2.4.1 碳源種類及濃度對(duì)菌株酶活性的影響

由圖4.A可知,菌株T1可利用高粱、玉米、大豆、水稻、小麥及CMC-Na等碳源,但以玉米粉作為碳源時(shí),酶活性最高(8.83 U·mL-1), 以小麥為碳源時(shí),酶活性最低(5.34 U·mL-1)。由于玉米粉來源廣,價(jià)格低廉,因此選擇玉米粉作為最佳碳源。由圖5.B可知,當(dāng)玉米粉濃度為1.5%時(shí), 酶活性最高(9.48 U·mL-1), 隨著濃度的上升,酶活性降低。因此選擇濃度為1.5%的玉米粉作為最佳碳源進(jìn)行后續(xù)研究。

圖4 不同碳源和玉米粉濃度對(duì)酶活性的影響*Fig.4 Effect of carbon source and corn flour concentration on enzyme activity* C1. 高梁; C2. 玉米; C3. 大豆; C4. CMC-Na; C5. 水稻; C6. 小麥。* C1. sorghum; C2. millet; C3. bean; C4.CMC-Na ; C5. rice; C6. wheat.

圖5 不同氮源和蛋白胨濃度對(duì)酶活性的影響*Fig.5 Effect of nitrogen source and peptone concentration on enzyme activity* N1. 蛋白胨; N2. 硫酸銨; N3. 硝酸銨; N4. 明膠。* N1. peptone; N2. (NH4)2SO4; N3. NH4NO3; N4. gelatin.

2.4.2 氮源種類及濃度對(duì)菌株酶活性的影響

由圖6.A可知,菌株T1可利用蛋白胨、硫酸銨、明膠、硝酸銨等氮源,其中以蛋白胨為氮源時(shí)酶活性最高,以硝酸銨為氮源時(shí)酶活性最低。由圖6.B可知,當(dāng)?shù)鞍纂藵舛葹?%時(shí)酶活性最高。因此以1%蛋白胨作為最佳氮源進(jìn)行后續(xù)研究。

圖6 不同接種量對(duì)菌株T1酶活性的影響Fig.6 Effect of different inoculation amount on enzyme activity

2.4.3 菌液接種量對(duì)菌株酶活性的影響

由圖6可知,菌液接種量明顯影響酶活性,當(dāng)接種量為5%時(shí)酶活性最高(11.49 U·mL-1); 接種量超過5%后,酶活性降低,因此最佳接種量為5%。

2.5 菌株T1分泌纖維素酶的酶學(xué)特性

2.5.1 纖維素酶的最適pH和pH穩(wěn)定性

以CMC-Na為底物,在緩沖溶液中測(cè)定纖維素酶的最適pH。由圖7.A可知,菌株T1分泌的纖維素酶最適pH為4.8, 在pH 3～4.8時(shí),隨著pH的增加酶活性升高,當(dāng)pH超過4.8后酶活性降低。在37 ℃條件下,將纖維素酶在不同緩沖液中保溫1 h, 以未處理的粗酶液為100%計(jì)算殘存酶活性百分比,即相對(duì)酶活性。由圖7.B所示,在pH 4～8范圍內(nèi)酶活性均保持在60%以上,說明菌株T1分泌的纖維素酶具有良好的耐酸堿性。

圖7 不同pH對(duì)酶活性和酶穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of different pH on activity and stability of cellulase

2.5.2 纖維素酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性

由圖8.A可知,在溫度40 ℃時(shí)酶活性最高,且隨著溫度的升高,酶活性逐漸降低。由圖8.B可知,當(dāng)溫度為40～50 ℃時(shí),酶活性保持在80%以上,穩(wěn)定性強(qiáng); 當(dāng)溫度為50～80 ℃時(shí),酶活性迅速下降。

圖8 不同溫度對(duì)酶活性和酶穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of different temperature on activity and stability of cellulose

2.5.3 纖維素酶的最佳反應(yīng)時(shí)間

由圖9可知,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長,酶活性增高,在反應(yīng)時(shí)間40 min 時(shí)酶活性最高,此后酶活性降低。

圖9 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶活性的影響Fig.9 Effect of different reaction time on enzyme activity

3 討論

本研究采用以CMC-Na為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基,通過剛果紅染色初篩, DNS法測(cè)定酶活性復(fù)篩出1株纖維素分解菌,這是一種簡(jiǎn)單、快捷、低成本的方法。最終確定T1菌株為布氏田鼠盲腸內(nèi)產(chǎn)纖維素酶的優(yōu)勢(shì)菌,并對(duì)其進(jìn)行16SrDNA分子生物學(xué)鑒定,鑒定確認(rèn)菌株T1為枯草芽孢桿菌的一種。本研究結(jié)果豐富了布氏田鼠腸道源纖維素降解菌的種類,為高效菌株T1的纖維素酶利用提供了理論基礎(chǔ)。

目前,國內(nèi)已有較多纖維素分解菌的相關(guān)研究報(bào)道。何靜等[15]從雙峰駝糞便中篩選出多株纖維素分解菌,其中酶活性最高的一株是纖維化纖維微菌(Cellulosimicrobiumcellulans), 經(jīng)過優(yōu)化后酶活性可達(dá)0.66 U·mL-1。蘇少鋒[16]從蒙古馬腸道中獲得一株高產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌,經(jīng)鑒定該菌為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens), 優(yōu)化后酶活性可達(dá)0.92 U·mL-1。 也有研究從落葉土壤、高溫好氧堆肥中分離出能降解纖維素的細(xì)菌,如短小芽孢桿菌[17]、嗜熱脂肪芽孢桿菌[18]等。

枯草芽孢桿菌屬于好氧、嗜溫、產(chǎn)芽孢的革蘭陽性短桿菌[19], 廣泛存在于動(dòng)物腸道、土壤以及腐敗的有機(jī)物中[20]。吳麗娟等[21]研究表明,枯草芽孢桿菌可拮抗腸道中有害菌群增殖,具有維護(hù)腸道內(nèi)環(huán)境平衡和增強(qiáng)免疫力等功能。本研究經(jīng)條件優(yōu)化后酶活性可達(dá)11.49 U·mL-1, 高于陳龍等[22]從梅花鹿新鮮糞便中分離出的枯草芽孢桿菌酶活性(1.106 U·mL-1), 以及高于徐榮[23]從白蟻腸道中分離出的枯草芽孢桿菌酶活性(3.6 U·mL-1), 因而具有廣闊的應(yīng)用前景。

諸多研究表明,菌株的發(fā)酵條件,如碳源、氮源、溫度、pH和接種量等均會(huì)影響纖維素酶活性[24]。關(guān)于產(chǎn)酶條件的優(yōu)化,高云航等[25]從白蟻腸道中分離出最強(qiáng)菌株MX5, 以0.5%秸稈為碳源、0.5%酵母粉和硫酸銨混合物為氮源、接種量1%時(shí),產(chǎn)酶活性最高。楊偉平等[26]從藏豬腸道中分離出BacillussublitisBY-2, 其發(fā)酵所需的最佳碳源為1%玉米粉、最佳氮源為2%蛋白胨和酵母粉的復(fù)合物,在發(fā)酵起始pH值5.5、接種量4%時(shí)產(chǎn)纖維素酶量高且穩(wěn)定。本研究結(jié)果表明,在產(chǎn)酶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以1.5%玉米粉為碳源、1%蛋白胨為氮源、5%接種量時(shí)酶活性最高。這與高云航等[25]研究結(jié)果不同。雖然菌株均從腸道中分離得到,但由于存在不同菌株以及不同菌株來源等原因,使得最佳產(chǎn)酶條件差異很大。該酶最適溫度為40 ℃、最適pH為4.8, 具有一定的耐酸性和耐熱性,因此在食品行業(yè)或廢料處理等方面具有較廣的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

以布氏田鼠盲腸內(nèi)容物為研究對(duì)象,初篩出8株具有分解纖維素能力的菌株,發(fā)酵法復(fù)篩出分解能力最強(qiáng)的菌株T1, 經(jīng)鑒定確定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilisstrain)。菌株T1以1.5%玉米粉作為碳源、1%蛋白胨作為氮源、接種量為5%時(shí)產(chǎn)纖維素酶量最高。該纖維素酶最適反應(yīng)pH為4.8, 最適反應(yīng)溫度為40 ℃, 最佳反應(yīng)時(shí)間為40 min, 且具有一定的酸堿耐受性和熱穩(wěn)定性。