迪明博, 王潤坤, 鄒美佳, 薛詩意, 劉 量*

(1. 揚州大學醫(yī)學院(轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究院)/ 江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點實驗室, 江蘇揚州 225009; 2. 盱眙縣人民醫(yī)院藥劑科, 江蘇盱眙 211700; 3. 江蘇省連云港中醫(yī)藥高等職業(yè)技術學校, 江蘇連云港 222007)

見血青為蘭科(Orchidaceae)羊耳蒜屬脈羊耳蘭(Liparisnervosa)的全草,是附生或地生的藥用草本植物,廣泛分布于我國江西、浙江、湖南南部、廣西、四川及貴州等地,生長于海拔1 000～2 100 m地區(qū),常見于叢林蔭處和溪谷旁[1]。見血青在《中華本草》[1]和《中藥大辭典》[2]等均有收錄,其味苦、性涼,具有清熱解毒、補肺止血等功效,常用于治療勞傷咳嗽等[3]。

見血青含菲類、苯丙素類和酚酸類等多種酚類成分。從見血青中分離到的3個新雙菲類化合物對胃癌HGC-27細胞和結(jié)腸癌HT-29細胞具有顯著的腫瘤細胞毒活性[4]; 苯丙素類成分具有顯著的體外抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性[5]; 見血青中酚類成分具有多種生物活性。然而,目前國內(nèi)外尚未見對見血青酚類成分提取工藝的報道。

超聲輔助能在中草藥成分提取過程中通過空穴作用和擾動效應,有效地破壞植物細胞膜和細胞壁,增加溶劑穿透細胞膜的能力,從而大大提高有效成分的提取率和藥材的利用率,縮短提取時間。同時,超聲輔助提取可不加熱, 通過超聲的熱機制,即利用超聲波的振動能量不斷被傳播介質(zhì)吸收轉(zhuǎn)變?yōu)闊崃?從而使得傳播介質(zhì)溫度升高,這種升溫方式不同于其他加熱方法,能很好地保持提取物的結(jié)構(gòu)和特性[6]。鑒于超聲波輔助提取法的諸多優(yōu)勢,本研究采用超聲波輔助提取法,通過分析超聲功率、乙醇濃度、料液比和提取時間等不同因素對見血青酚類成分提取效率的影響規(guī)律,以確定見血青酚類成分超聲輔助提取的最佳工藝條件,并與浸漬和加熱回流提取這2種傳統(tǒng)的提取工藝進行比較,為見血青的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

見血青購自重慶市黔江區(qū),由揚州大學醫(yī)學院劉量副教授鑒定為蘭科羊耳蒜屬藥用植物見血青[Liparisnervosa(Thunb. ex A. Murray) Lindl.]全草。

沒食子酸(純度≥98%, 美國Sigma-Aldrich公司,產(chǎn)品批號為PHL89198); 福林酚(合肥博美生物公司產(chǎn)品); 無水乙醇(分析純)、無水碳酸鈉(國藥集團化學試劑公司)。

高速萬能粉碎機(天津泰斯特儀器公司); 數(shù)字顯示恒溫水浴鍋(HH系列,上海江星儀器公司); 酶標儀(Synergy 2型,美國Bio-Tek公司); 高速離心機(德國Eppendorf公司); 數(shù)控超聲波清洗器(KQ-500DE型,昆山禾創(chuàng)超聲儀器公司); 超純水機(四川優(yōu)普科技公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 見血青的預處理

將見血青干燥至恒重,用萬能粉碎機粉碎,密封保存于干燥環(huán)境中備用。

1.2.2 見血青酚類成分的提取

1) 超聲輔助提取: 精密稱取適量見血青粉末,以一定的料液比[見血青粉末(g)∶乙醇(mL)], 按照一定的乙醇濃度、提取時間以及用一定的超聲功率進行輔助提取,重復3次。提取后,將混合物減壓過濾并除去濾渣,留取濾液,將濾液于4 ℃下5 000 r·min-1離心20 min, 吸取上清液并于4 ℃儲存?zhèn)溆?儲存期不超過3 d[6]。

2) 浸漬提取: 精密稱取見血青粉末1 g及量取72%乙醇溶液72 mL, 重復3次,攪拌均勻后于常溫下靜置24 h。提取后,將混合物過濾、濾液于4 ℃下5 000 r·min-1離心20 min, 吸取上清液于4 ℃儲存, 3 d內(nèi)使用。

3) 加熱回流提取: 稱取見血青粉末10 g于燒瓶中,加入720 mL 72%乙醇溶液, 重復3次, 在85 ℃水浴條件下加熱提取3 h, 所得溶液同上述方法過濾、離心,并于4 ℃存儲, 3 d內(nèi)使用。

1.2.3 單因素試驗

采用單一變量原則,通過單因素試驗分別考查超聲波功率(200、250、300、350、400和450 W)、乙醇濃度(20%、40%、60%、80%和100%)、料液比[1∶20、1∶40、1∶60、1∶80和1∶100 (g∶mL)]和提取時間(10、20、30、40、50和60 min) 4個因素對總見血青酚類成分得率的影響[7]。

1) 超聲功率對見血青酚類成分得率的影響: 精密稱取適量見血青粉末于具塞錐形瓶中,以料液比1∶40 (g∶mL)加入一定體積的40%乙醇溶液,分別在超聲功率200、250、300、350、400和450 W的水浴中超聲15 min, 隨即將混合物減壓抽濾,放冷,去除濾渣,濾液振蕩搖勻后取適量置于離心機中,于4 ℃下5 000 r·min-1離心20 min, 提取3次,離心后吸取上清液進行酚類成分得率測定,繪制超聲波功率對得率影響的柱形圖。

2) 乙醇濃度對見血青酚類成分得率的影響: 精密稱取適量見血青粉末于具塞錐形瓶中,分別以料液比1∶40 (g∶mL)加入不同濃度20%、40%、60%、80%和100%的乙醇溶液,在超聲功率350 W的水浴中超聲15 min, 隨即將混合物減壓抽濾,放冷,去除濾渣,其余步驟同上,繪制乙醇濃度對得率影響的柱形圖。

3) 料液比對見血青酚類成分得率的影響: 精密稱取見血青粉末于具塞錐形瓶中,分別以料液比1∶20、1∶40、1∶60、1∶80和1∶100 (g∶mL)加入濃度80%的乙醇溶液,在超聲功率350 W的水浴中超聲15 min, 隨即將混合物減壓抽濾,放冷,去除濾渣,濾液振蕩搖勻后于離心機中離心20 min, 提取3次,離心后吸取上清液進行酚類成分得率測定,繪制料液比對得率影響的柱形圖。

4) 提取時間對見血青酚類成分得率的影響: 精密稱取適量見血青粉末于具塞錐形瓶中,以料液比1∶60 (g∶mL)加入濃度80%的乙醇溶液,分別在超聲功率350 W的水浴中超聲10、20、30、40、50和60 min, 隨即將混合物減壓抽濾,放冷,去除濾渣,濾液振蕩搖勻后于離心機中離心20 min, 提取3次,離心后吸取上清液進行酚類成分得率測定,繪制提取時間對得率影響的柱形圖。

1.2.4 響應面試驗設計

通過固定1個因素和改變其他因素,采用基于Box-Behnken試驗設計的響應面方法對提取條件進行優(yōu)化,研究3個自變量[乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)]對因變量酚類成分得率(R)的影響。根據(jù)單因素分析結(jié)果選擇自變量的水平,根據(jù)3因素和3水平的響應面試驗設計,選擇17個自變量組合,并重復5次中心檢驗(0, 0, 0), 以驗證提取過程的標準誤差和重復性,試驗因素及其水平設計見表1。

表1 響應面試驗設計的因素和水平表Tab.1 Factors and levels for response surface experimental design

1.2.5 酚類成分得率的測定

1) 沒食子酸標準曲線的繪制: 精密稱取沒食子酸標準品10.00 mg, 加適量無水乙醇溶解,用蒸餾水定容于250 mL的容量瓶中配制成0.04 mg·mL-1

的標準品溶液,用移液槍精密吸取一定體積并稀釋成不同濃度的40、20、10、5、2.5、1.25、0.625 μg·mL-1標準品溶液,吸取不同濃度的沒食子酸標準品溶液2.5 mL于10 mL的EP管中,分別加入 2.5 mL福林酚(10%), 充分搖勻,反應5～6 min后加入150 μL Na2CO3(20%)溶液,室溫反應2 h 至吸光度值穩(wěn)定,精密吸取200 μL于96孔板中,以無水乙醇作為空白對照, 765 nm波長下測定吸光度值,平行試驗3次,取平均值后進行標準曲線的繪制[8]。以吸光度為橫坐標,濃度為縱坐標,得回歸方程為Y=36.198X-0.666 6 (R2=0.999 3), 沒食子酸濃度在0.062 5～40 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關系。

2) 見血青酚類成分得率的計算: 精密吸取離心后上清液,用蒸餾水定容至10 mL容量瓶中,得到不同濃度的待測液,精密吸取2.5 mL于10 mL的EP管中,同沒食子酸標準曲線的試驗操作測定吸光度值,計算見血青的總酚得率:M=X×V×N/(m×D×1 000)。式中,M為見血青的酚類成分得率(mg·g-1);X為標準品沒食子酸濃度(μg·mL-1);V為提取液的體積(mL);N為稀釋倍數(shù)(10);m為樣品質(zhì)量(g);D為干重(%)。

1.3 統(tǒng)計學分析

所有試驗均重復3次, 用GraphPad Prism 6和IBM SPSS Statistics 26軟件進行數(shù)據(jù)處理,用Design-Expert 12.0軟件進行結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗分析及其結(jié)果

2.1.1 超聲功率對見血青酚類成分得率的影響

由圖1可知,當超聲功率設定在200～350 W之間時,隨著超聲功率的增大,酚類成分得率隨之增加,可能是因為隨著超聲波對植物細胞壁的破壞作用增強,加快細胞內(nèi)酚類物質(zhì)的溶出,因此溶液中酚類物質(zhì)的含量也逐漸增加。超聲功率在 350～450 W 之間時,隨著超聲功率的增加,酚類成分得率反而逐漸下降,其原因可能是超聲功率過大,導致細胞內(nèi)容物大量溶出,增加溶液黏度和濃度,從而抑制酚類物質(zhì)的溶出,通過單因素方差分析和鄧肯多重范圍檢驗選擇350 W的超聲功率為最佳提取條件[9]。

圖1 超聲功率對酚類成分得率的影響*Fig.1 Effect of ultrasonic power on phenol yield* 條形圖上字母表示不同水平之間的顯著性差異(鄧肯多重范圍檢驗, P<0.05)。* Different letters on the bars indicate significant differences between lev-els (Duncan’s multiple range test, P<0.05).圖2 乙醇濃度對酚類成分得率的影響*Fig.2 Effect of ethanol concentration on phenol yield* 條形圖上字母表示不同水平之間的顯著性差異(鄧肯多重范圍檢驗, P<0.05)。* Different letters on the bars indicate significant differences between levels (Duncan’s multiple range test, P<0.05).

2.1.2 乙醇濃度對見血青酚類成分得率的影響

由圖2可知,隨著乙醇濃度的增加,見血青酚類成分得率呈增加趨勢,并在乙醇濃度為80%時達到最大值。當乙醇濃度大于80%時,酚類成分得率下降,這可能是由于乙醇濃度為80%時的極性與一些酚類物質(zhì)的極性接近,在乙醇濃度大于80%時,醇溶性雜質(zhì)大量增加,從而影響酚類物質(zhì)的提取[10]。通過單因素方差分析和鄧肯多重范圍檢驗選擇提取液乙醇濃度80%為最佳提取條件。

2.1.3 料液比對見血青酚類成分得率的影響

由圖3可知,在料液比1∶(20～60) (g∶mL)范圍內(nèi),料液比對見血青酚類成分得率有顯著的影響,酚類成分得率隨料液比的增大而提高,這是因為隨料液比增加,溶劑用量增大,體系濃度差增大,酚類物質(zhì)很容易被提取出來。當料液比大于 1∶60 (g∶mL)后,酚類成分得率下降并趨于穩(wěn)定,這是由于當溶劑用量增大到一定程度時,濃度差減小,酚類成分溶出速率減小,且料液比過大,會削弱超聲波破碎植物細胞的能力,從而降低酚類成分得率。通過單因素方差分析和鄧肯多重范圍檢驗選取料液比1∶60 (g∶mL) 為最佳提取條件。

圖3 料液比對酚類成分得率的影響*Fig.3 Effect of solid-liquid ration on phenol yield* 條形圖上字母表示不同水平之間的顯著性差異(鄧肯多重范圍檢驗, P<0.05)。 * Different letters on the bars indicate significant differences between levels (Dun-can’s multiple range test, P<0.05).圖4 提取時間對酚類成分得率的影響*Fig.4 Effect of extraction time on phenol yield* 條形圖上字母表示不同水平之間的顯著性差異(鄧肯多重范圍檢驗, P<0.05)。* Different letters on the bars indicate significant differences between levels (Duncan’s multiple range test, P<0.05).

2.1.4 提取時間對見血青酚類成分得率的影響

由圖4可知,在提取時間10～50 min范圍內(nèi),隨著提取時間的增加酚類成分得率增加,在提取時間50～60 min范圍內(nèi),隨著提取時間增加,酚類成分得率下降,這是因為在開始超聲的過程中植物細胞逐漸破碎,酚類物質(zhì)緩慢釋放,隨著超聲時間的增加,細胞受超聲影響的程度增大,酚類物質(zhì)溶出增加。但是由于超聲的熱機制,長時間可能造成酚類物質(zhì)的氧化,破壞其結(jié)構(gòu),酚類成分得率減少。通過單因素方差分析和鄧肯多重范圍檢驗選擇提取時間以50 min為最佳提取條件。

2.2 響應面法工藝優(yōu)化結(jié)果及分析

2.2.1 響應面試驗設計及試驗結(jié)果

利用Design-Expert 12.0軟件中的Box-Behnken試驗設計原理構(gòu)建了試驗方案,依此方案進行試驗,得到了乙醇濃度、料液比、提取時間3個因素對見血青酚類成分得率的響應試驗結(jié)果(表2)。

表2 設計方案和試驗結(jié)果Tab.2 Design solutions and experimental results

2.2.2 試驗模型與響應面試驗結(jié)果方差分析

由表3可知,模型的F=61.64, 表明所建立的數(shù)學模型是合理的; 模型的P<0.000 1, 說明模型達到極顯著水平; 失擬項的P>0.05, 說明試驗結(jié)果重復性較好,試驗誤差小。決定系數(shù)R2=0.958 2, 說明該模型所得出的預測值有較好的可信度; 校正后的決定系數(shù)Radj2=0.971 5與R2接近,說明此模型能解釋97.15%的效應值變化; 變異系數(shù)CV=3.03% (反映模型的置信度,CV值越低,該模型的置信度越高), 說明模型方程能很好地反映真實試驗值[11]。綜上,此模型可用于優(yōu)化試驗設計與結(jié)果分析,以確定超聲提取見血青中酚類物質(zhì)的最佳工藝。

在影響因素的一次項結(jié)果中,乙醇濃度和料液比對酚類成分得率的影響達極顯著水平,提取時間對酚類成分得率影響的顯著性相對較低(P=0.066 1), 根據(jù)各因素的P值大小可以判斷,各影響因素對見血青酚類成分得率的影響由強到弱依次為乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)。由二次項結(jié)果可知,乙醇濃度和料液比對酚類成分得率的影響極顯著。在交互作用下,料液比和提取時間的交互影響達到顯著水平,各因素交互作用的顯著性差異也說明提取條件對見血青酚類成分得率的影響復雜,有必要對其進行響應面分析優(yōu)化。

為進一步明確各因素的影響,利用Design-Expert 12.0 軟件對方差分析的結(jié)果進行二次回歸分析和二項式擬合,得到以見血青酚類成分得率(R)為響應值的二次回歸方程:R=-40.587 25+1.194 61A+0.150 100B+0.144 625C-0.000 631AB-0.001 350AC+0.002 387BC-0.007 367A2-0.001 474B2-0.001 520C2。

2.2.3 響應面分析

根據(jù)回歸方程,作出各因素的交互作用對見血青酚類成分得率影響的響應面圖,如圖5.A-C所示。響應面的彎曲趨勢可反映各因素交互作用對響應值的影響效果。

由圖5.A可知,乙醇濃度從60%增加到80%時,酚類成分得率逐漸增大,當乙醇濃度大于80%時,由于醇溶性物質(zhì)的溶出,酚類成分得率緩慢減小。圖5.B進一步說明乙醇濃度相對于提取時間對酚類成分得率的影響更顯著,隨著乙醇濃度的升高和提取時間的增加,在乙醇濃度為80%和提取時間為54 min 時酚類成分得率達到最大值。圖5.C可知,料液比和提取時間之間沒有顯著反向交互作用,在水平范圍內(nèi),隨著料液比的增加,酚類成分得率顯著增加[12]。

2.2.4 模型的優(yōu)化及驗證

經(jīng)過響應面分析,得到提取見血青酚類物質(zhì)提取的最佳工藝條件: 乙醇濃度為72.441 8%,料液比為1∶71.953 8 (g∶mL), 提取時間為54.069 9 min, 在此條件下,見血青酚類成分得率的理論值為14.546 mg·g-1?？紤]到工藝條件和實際操作的可行性,調(diào)整乙醇濃度為72%, 料液比為1∶72 (g∶mL), 提取時間為54 min, 進行3組平行試驗,得到見血青酚類成分得率為(14.31±1.26) mg·g-1, 與響應面預測的理論得率相比,相對誤差約為0.02%, 說明模型擬合合理,該工藝條件適用于見血青酚類物質(zhì)的提取,該工藝具有實用價值[15]。

2.3 超聲輔助提取與其他提取工藝的比較

在確定了超聲輔助提取法從見血青中提取酚類成分的最佳條件后,比較其與浸漬提取和加熱回流提取這2種傳統(tǒng)提取工藝提取效果的差異,結(jié)果見表4。超聲輔助提取、浸漬提取和加熱回流提取法在相同的乙醇濃度和料液比提取條件下,浸漬提取和加熱回流提取所得酚類成分得率分別為(9.63±0.67)和(10.73±0.05) mg·g-1, 低于超聲輔助提取的酚類成分得率(14.31±1.26) mg·g-1, 說明超聲輔助提取法可在相對于加熱回流提取低的溫度下,在更短的時間內(nèi)從見血青中提取較多的酚類物質(zhì),同時還提高原料的利用率。

表4 超聲波輔助提取、浸漬提取及加熱回流提取酚類成分得率的比較☆Tab.4 Comparison of phenol yield obtained from ultrasound-assisted extraction, maceration extraction and heated reflux extraction

3 討論

本研究以單因素試驗為基礎結(jié)合響應面試驗設計對見血青酚類成分提取工藝進行了優(yōu)化。首先通過單一變量原則研究超聲功率、乙醇濃度、料液比和提取時間4個因素對酚類成分得率的影響。通過單因素方差分析和鄧肯多重范圍檢驗發(fā)現(xiàn), 4個因素對酚類成分得率均有影響,其中超聲功率為350 W時酚類成分得率最大,其他3個因素的最佳提取條件分別為乙醇濃度80%、料液比1∶60 (g∶mL)和提取時間50 min。在單因素試驗的基礎上,通過Box-Behnken試驗設計對見血青酚類成分提取的影響因素進行了響應面分析,通過響應面方差分析,得出各影響因素對見血青酚類成分得率的影響由強到弱依次為乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)。通過3個水平的試驗設計得到的最佳提取工藝條件為超聲功率350 W、乙醇濃度72%、料液比1∶72 (g∶mL)、提取時間54 min, 在此條件下,見血青酚類成分得率可達(14.31±1.26) mg·g-1。

浸漬提取、加熱回流提取和索氏提取等常用提取方法耗時久、得率低。隨著技術的進步和發(fā)展,中藥提取引入了一些新的方法,例如微波萃取和超聲輔助提取,然而微波萃取在理論和實踐中還存在一些問題,如有微波穿透物質(zhì)內(nèi)部時的衰減、操作難度大、要求高和有機溶劑的殘留等問題。超聲輔助提取相對于傳統(tǒng)提取方法和微波萃取,具有環(huán)境友好、提取效率高和操作簡便等特點,顯示出優(yōu)勢[13]。熊利芝等[14]研究表明,利用超聲波輔助提取法和索氏提取法從秦皮中提取香豆素,超聲輔助提取的提取率是索氏提取的2倍多,而耗時僅是索氏提取的1/28。 本研究比較了超聲輔助提取、浸漬提取和加熱回流提取3種方法獲得的酚類成分得率的差異。采用與超聲輔助提取法相同的乙醇濃度(72%)和料液比[1∶72 (g∶mL)], 利用浸漬、加熱回流提取法對見血青酚類成分進行提取。從酚類成分得率來看,超聲輔助提取工藝極顯著高于加熱回流提取和浸漬提取; 從提取溫度來看,超聲輔助提取工藝能在較低的溫度下達到最好的提取效果; 從提取時間來看,超聲輔助提取所需時間比加熱回流提取和浸漬提取短,僅需54 min。相對于加熱回流提取和浸漬提取,超聲輔助提取無需高溫加熱不僅能很好地保護酚類成分的結(jié)構(gòu)和特性,還能通過超聲波的機械粉碎機制和空化作用提高酚類成分得率,是一種較為理想的提取方法。

綜上,超聲輔助提取相對于傳統(tǒng)提取方法具有更好的提取效果。從化學成分和生物活性角度綜合考慮,后續(xù)進行見血青酚類化學成分的研究可重點關注超聲輔助提取,通過超聲輔助提取方法所得的酚類成分含量更高,有利于后續(xù)進行系統(tǒng)的成分分離、結(jié)構(gòu)鑒定和活性分析,為創(chuàng)新藥物的研究提供更多的活性成分。

4 結(jié)論

見血青含多種酚類成分,可能是其發(fā)揮藥效的主要活性成分。超聲輔助提取見血青酚類成分是一種高效節(jié)能的方法,值得今后深入研究。