馮書堂 李 莉 李國平 楊潔容 王太平

(北京蓋蘭德生物科技有限公司,北京 102206)

豬是人類異種器官移植理想供體,培育的五指山小型豬(Wuzhishan mini-pig,WZSP)近交系,較之普通豬具有四大應(yīng)用優(yōu)勢[1-3]。但由于豬細(xì)胞表面上主要存在以aGal 為主的三種不同的、引起異種移植發(fā)生超急性免疫排斥反應(yīng)的抗原,以及幾乎所有豬品種基因組中含有PERV基因,是影響其在異種醫(yī)用材料、異種移植研究和應(yīng)用的主要障礙之一[4-5]。據(jù)文獻(xiàn)報道[4],aGal基因存在所有品種豬基因組;西雙版納小型豬隨著近交系數(shù)的增高,其外周血小板aGal表達(dá)量逐步減少,這就意味著隨著近交繁育深入進(jìn)行,有可能逐步延緩異種移植免疫排斥反應(yīng)現(xiàn)象的發(fā)生。本研究擬以育成的WZSP近交系豬為材料[1,6-8],測定其不同近交世代個體和培育的近交系aGal/b4GalNT2雙敲基因豬(以下簡稱:雙敲基因豬)繁育的后代、外周血紅細(xì)胞aGal表達(dá)量及變化規(guī)律[9],以及對aGal/b4GalNT2基因敲除豬繁育后代純合子、雜合子分離結(jié)果的期待。為其異種醫(yī)用生物材料等產(chǎn)品研究和應(yīng)用,以及產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；a(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

目前,有關(guān)近交系豬紅細(xì)胞aGal表達(dá)水平測定研究未見報道。因此,本研究結(jié)果對異種醫(yī)用材料研究等有著重要的實用意義[4-5]。

1 材料和方法

1.1 材料

F19-28WZSP豬,共計55頭[1,6],雙敲基因修飾豬后代45頭[9],實驗組樣品共計100頭,并設(shè)對照組。實驗組1:近交系F27-28共計26頭;實驗組2:近交系F248頭;實驗組3:近交系F19-21共計21頭;實驗組4:近交系雙敲基因豬后代F1-3等待測定豬共計45頭;對照組:未加IB4-FITC的紅細(xì)胞。均由北京蓋蘭德生物技術(shù)有限公司提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號【SCXK(京)2020-0006】。

1.2 方法

1.2.1利用股隱動脈[1]:進(jìn)行無菌采集血液,每頭豬采血2～3 mL裝入抗凝管。管上標(biāo)注對應(yīng)號碼,注入血液之后馬上輕柔快速翻轉(zhuǎn)試管,保證血液不凝后放入保溫箱。

1.2.2實驗室紅細(xì)胞分離方法:1)將采集的豬血置于抗凝管中,混合均勻備用;2)取分層的抗凝血下層紅細(xì)胞1 mL,加入1 mL PBS重懸,然后將重懸后的紅細(xì)胞緩慢加入3 mL GE Ficoll-Paque Plus中,20 ℃,300 r/min離心30 min;3)離心后溶液產(chǎn)生分層,下層為紅細(xì)胞,將紅細(xì)胞小心轉(zhuǎn)移到新的15 mL離心管中,在離心管中加入10 mL PBS充分重懸紅細(xì)胞,500 r/min 10 min離心后棄上清;4)重復(fù)步驟3,2～3次,然后對收集的紅細(xì)胞進(jìn)行計數(shù);5)使用PBS稀釋DBA(凝集素)至推薦濃度,按照說明書推薦用量孵育30 min;6)使用PBS洗滌,洗滌條件500 r/min 10 min;7)使用BD Ariana III流式熒光分選儀、上機(jī)測試;8)檢測不同組合樣品1 000個PBMC中,表達(dá)aGal的抗原陽性細(xì)胞數(shù)量的百分比(%)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗組與對照組之間的比較用t檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 aGal抗原陽性細(xì)胞數(shù)量及表達(dá)量測定

F27出現(xiàn)2頭aGal抗原陽性細(xì)胞數(shù)量的百分比極低個體,分別為16.2%和19.5%;組1與組3個體aGal抗原陽性細(xì)胞數(shù)量的平均值百分比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

100頭WZSP近交系不同世代、待測定的雙敲基因修飾后代豬(含已測定GGTA1/b4GalNT2+hCD46+hCD55+hTBM五基因修飾純合子豬)和對照組的測定結(jié)果見表1,2和圖1,2。

圖1 實驗組與對照組外周血紅細(xì)胞aGal表達(dá)水平Fig.1 The expression level of peripheral red blood cells in the experimental group and the control group was plotted

表1 近交系小型豬不同世代實驗組與對照組aGal抗原陽性細(xì)胞測定結(jié)果Table 1 Determination of aGal expression level of peripheral red blood cells in pigs offspring of the Inbred mini-pig at the different generations

從圖1可知,隨著近交系代數(shù)提高,其個體紅細(xì)胞aGal表達(dá)量逐步減低。

從圖2可知,五基因修飾豬、雙敲基因純合子豬和近交系F20豬等部分實驗組與對照組紅細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)aGal綠色的熒光反應(yīng),而實驗組F20的D16號豬檢測到其紅細(xì)胞aGal具有較強(qiáng)的綠色熒光表達(dá)效果。

圖2 部分實驗組與對照組測定熒光反應(yīng)檢測圖Fig.2 Detection chart of fluorescence reaction between some experimental groups and control groups

2.2 近交系各世代紅細(xì)胞aGal免疫熒光檢測

組1:近交系F27-2826頭紅細(xì)胞aGal免疫熒光反應(yīng)百分率平均值為56.17%。其中低于50% 6頭,占23.08%;50%～60% 8頭,占30.77%;高于60% 的12頭,占46.15%;其最低值16.2%,最高值86.2%。

組2:近交系F248頭紅細(xì)胞aGal細(xì)胞免疫熒光反應(yīng)百分率平均值65.39%,其中低于50% 2頭,占25%;50%～60% 2頭,占25%;高于60% 4頭,占50%,其最低值35.5%,最高值99.2%。

組3:F19-2121頭紅細(xì)胞aGal細(xì)胞免疫熒光反應(yīng)百分率平均值為82.15%,其中低于50% 2頭,占9.1%;50%～60% 6頭,占28.57%;高于60% 13頭,占61.91%;最低值38.8%、最高值89.4%。組1(56.17%)與組3(82.15%)的平均值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

組4:其中8頭GGTA1/b4GalNT2雙敲基因豬繁育后代和1頭已知為GGTA1/b4GalNT2+hCD46+hCD55+hTBM五基因修飾純合子豬的紅細(xì)胞aGal免疫熒光反應(yīng)測定值為0.01%,其余aGal/b4GalNT2雙敲基因豬繁育后代中,有2頭測定值分別為0.02%、0.03%,有4頭aGal免疫熒光反應(yīng)數(shù)值高達(dá)52.67%～76.40%,其余28頭測定平均值為31.03%(9.0%～49.2%)。

組5:對照組未加IB4-FITC的紅細(xì)胞aGal免疫熒光反應(yīng)測定值為0.01%。

3 討論

實驗組近交系各世代、雙敲基因后代豬與對照組外周血紅細(xì)胞aGal表達(dá)測定數(shù)據(jù)分析比較列為表1,2和圖1,2。由圖、表分析可以得出,近交系F27-28與F24個體紅細(xì)胞aGal免疫熒光反應(yīng)百分比,每代降低3.07%;F24與F20相比個體紅細(xì)胞aGal免疫熒光反應(yīng)百分比,每代降低了4.19%。尤其是F27已出現(xiàn)2頭個體紅細(xì)胞aGal免疫熒光反應(yīng)百分比極低的個體(6.20%,19.50%)。表明,隨近交系代數(shù)推進(jìn),其紅細(xì)胞aGal細(xì)胞免疫熒光反應(yīng)強(qiáng)度數(shù)值呈逐步下降趨勢。其下降的比例略有差異(3.07%對4.19%),可能與采取實驗樣本數(shù)量不等有關(guān)。提示近交系豬從F19到F28隨近交系數(shù)提高,其個體紅細(xì)胞aGal免疫熒光反應(yīng)呈現(xiàn)逐步下降趨勢。尤其研究中發(fā)現(xiàn):近交系F27中,同窩1對種豬紅細(xì)胞aGal免疫熒光反應(yīng)表達(dá)量極低,為今后培育近交系aGal低表達(dá)量的新品系奠定基礎(chǔ),也為培育新品系和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

由表2結(jié)果發(fā)現(xiàn):雙敲基因修飾豬后代3619、3018、3607 三頭母豬和3608、3604、3608、3318、3020 五頭公豬,共計8頭豬與對照組紅細(xì)胞aGal免疫熒光反應(yīng)測定結(jié)果均為0.1%,與對照組取得一致性的結(jié)果,未發(fā)生aGal免疫熒光反應(yīng)。因此,可視為aGal/b4GalNT2基因敲除純合子個體;但有4頭測定值分別為0.02%、0.03%的可視為近似aGal/b4GalNT2基因敲除純合子個體;而有4頭aGal免疫熒光反應(yīng)數(shù)值高達(dá)52.67%～76.40%的個體,可視為配種后分離出來的非基因敲除豬個體;其中28頭aGal免疫熒光反應(yīng)平均數(shù)值為31.03%(9.0%～49.2%),可推測為雙敲基因豬繁育的雜合子后代,其紅細(xì)胞aGal免疫熒光反應(yīng)比值均低于50%。上述研究結(jié)果證實的GGTA1/b4GalNT2基因敲除純合子個體,可為其生物輔料產(chǎn)品提供一定的科學(xué)依據(jù)[9]。

表2 雙敲基因豬實驗組與對照組aGal抗原陽性紅細(xì)胞測定結(jié)果Table 2 Determination of aGal expression level of peripheral red blood cells in pigs offspring of the knock gene heterozygous pigs

不同豬品種、同一豬品種不同個體以及同一個體、不同器官或細(xì)胞aGal的表達(dá)量不同;同一個體血細(xì)胞的aGal表達(dá)量血小板>粒細(xì)胞>單一核細(xì)胞>紅細(xì)胞,血小板的aGal表達(dá)量是粒細(xì)胞的3倍,但不同豬個體相同血細(xì)胞的aGal表達(dá)量趨勢之間無顯著性差異[4]。因此,本研究首次利用aGal表達(dá)量最低的紅細(xì)胞進(jìn)行測定,取得的研究結(jié)果同樣具有一定的參考價值。

近交系豬具有特異的分子遺傳基礎(chǔ)[10-15],有關(guān)小型豬近交系豬紅細(xì)胞aGal表達(dá)水平測定研究尚未見報道,本研究測定數(shù)量有限,隨近交系推進(jìn)其個體aGal表達(dá)量,逐步降低機(jī)制有待深入研究。