侯紅平 張廣平 彭 博 魏曉露 王麗芳 宋 玲 高云航 陳騰飛 寧良菊

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所,北京 100700)(2.四川大學(xué)華西醫(yī)院干細(xì)胞與組織工程研究室,成都 610041)

高脂血癥是一種常見的血脂代謝異常的疾病,血脂異常通常與三酰甘油(triglyceride,TG)和膽固醇(cholesterol,CHO)增高密切相關(guān)。二者雖然可以通過生化檢測(cè)等方法快速便捷地得到,但是血脂異常對(duì)身體的損害往往不容易被發(fā)現(xiàn),且存在一定程度的忽視[1]。由于血脂異常的損傷持續(xù)存在,對(duì)身體各種組織和細(xì)胞持續(xù)造成威脅,隨著血脂水平的不斷升高,其損傷程度也會(huì)不斷加重,造成機(jī)體代謝紊亂[2],進(jìn)而產(chǎn)生動(dòng)脈粥樣硬化[3]、腎功能不全[4]、高血壓[5]等一系列嚴(yán)重危害人類健康的并發(fā)癥。因此,積極地預(yù)防和治療高脂血癥的發(fā)生和發(fā)展是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。

目前,高脂血癥動(dòng)物模型的制作方法有很多種,但最常用的還是高脂飼料喂養(yǎng)大鼠來制備。大鼠遺傳背景明確、價(jià)格低廉、方便飼養(yǎng)、血液和組織容易獲得,在脂質(zhì)代謝的研究中是一種應(yīng)用較為廣泛的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。但是,在制作模型的過程中,我們發(fā)現(xiàn),大鼠高脂血癥的周期不明確,有的為4周,有的為6周,有的為8周,同時(shí)模型制備過程中血脂水平的表達(dá)變化有待商榷[6-8]。為此,本研究通過高脂飼料喂養(yǎng)大鼠,通過設(shè)置不同實(shí)驗(yàn)周期,檢測(cè)各組動(dòng)物的血脂水平和氧化應(yīng)激水平,科學(xué)地分析和探討不同周期高血脂癥大鼠的血脂變化及其規(guī)律,為后續(xù)研究提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SD大鼠,雄性,60只,5～6周齡,體質(zhì)量150～170 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,生產(chǎn)許可證號(hào)【SCXK(京)2016-0011】。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障環(huán)境(SPF級(jí))中,使用許可證號(hào)【SYXK(京)2019-0003】。所有實(shí)驗(yàn)操作均按照中藥研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),倫理審批號(hào):2021B125-1。

1.1.2主要試劑和儀器:高速冷凍離心機(jī)(Sigma公司,型號(hào):3-18KS);全自動(dòng)生化分析儀(佳能集團(tuán),型號(hào):TBA-120FR)。

甘油三酯試劑盒,膽固醇試劑盒,高密度脂蛋白(high-density lipoprotein, HDL),低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL),天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST),丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT),丙二醛(malondialdehyde, MDA),均購于北京索萊寶科技有限公司。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)試劑盒,總抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)檢測(cè)試劑盒,均購于碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組:所有動(dòng)物在檢疫1 d,適應(yīng)5 d后,按體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組和處理組,兩組別再分為0,15,30,60 和90 d 5個(gè)小組,每組6只。對(duì)照組正常攝食飲水,處理組正常飲水,但給予高脂飼料(基礎(chǔ)飼料+15%豬油+20%蔗糖+1.2%膽固醇+0.2%膽酸鈉)喂養(yǎng),每天觀察余料,不夠時(shí)及時(shí)補(bǔ)充飼料,連續(xù)喂養(yǎng)90 d。實(shí)驗(yàn)期間,每周稱一次動(dòng)物體質(zhì)量,同時(shí)觀察動(dòng)物的飲食情況、外觀、活動(dòng)狀況等。

1.2.2處理動(dòng)物及檢測(cè)指標(biāo):在0,15,30,60和90 d不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)分別處理動(dòng)物。處理前動(dòng)物禁食約16 h后,48 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,腹主動(dòng)脈采血,肝稱重,部分肝組織置于4%多聚甲醛中,進(jìn)行HE病理染色觀察。血清3 000 r/min 離心15 min后,采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血脂水平和肝代謝指標(biāo)。部分肺組織勻漿后,3 000 r/min 離心15 min取上清,BCA檢測(cè)蛋白濃度,采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血脂水平和肝代謝指標(biāo)。同時(shí)利用試劑盒檢測(cè)血清中的氧化應(yīng)激指標(biāo),具體操作詳見說明書。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同周期大鼠的一般狀態(tài)觀察

對(duì)照組不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的動(dòng)物均能自主活動(dòng),精神狀態(tài)良好,毛色有光澤,二便正常。處理組大鼠造模開始初期,體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯,但15 d后,出現(xiàn)飲食減少,體質(zhì)量增長(zhǎng)有所降低的趨勢(shì),分析認(rèn)為與高脂飼料飲食密切相關(guān)。但30 d后,上述情況有所緩解,排便量增加,被毛暗淡無光澤,出現(xiàn)脫毛、行動(dòng)遲緩的狀態(tài),上述情況一直持續(xù)到90 d。

2.2 不同周期大鼠的體質(zhì)量及肝系數(shù)

對(duì)照組不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的動(dòng)物體質(zhì)量持續(xù)增加,肝系數(shù)基本在2 g/100 g左右。而處理組動(dòng)物體質(zhì)量自15 d增長(zhǎng)較為明顯,直到90 d體質(zhì)量與同時(shí)期的對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。處理組動(dòng)物的肝系數(shù)自30 d開始明顯增加,與對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示處理組的肝組織自30 d出現(xiàn)水腫等病變(表1)。

表1 不同周期大鼠體質(zhì)量及肝系數(shù)Table 1 Body mass and liver coefficient of rats

2.3 不同周期大鼠血清中血脂相關(guān)指標(biāo)和生化指標(biāo)的表達(dá)

與同周期的對(duì)照組相比,處理組30 和60 d TG明顯的升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但90 d的TG 與對(duì)照組相比,差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;處理組30 和60 d CHO明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),90 d的CHO有所降低,但與對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);處理組15、30、60和90 d的LDL較對(duì)照組有所升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);處理組60 和90 d的HDL、AST和ALT較對(duì)照組有所升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 不同周期大鼠血清中血脂相關(guān)指標(biāo)和生化指標(biāo)的表達(dá)Table 2 Expression of blood lipid-related indexes and biochemical indexes in serum of rats in different cycles

2.4 不同周期大鼠組織中血脂相關(guān)指標(biāo)和生化指標(biāo)的表達(dá)

與對(duì)照組相比,處理組的TG、LDL在15 d即明顯升高,CHO、HDL、AST和ALT在30 d明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

表3 不同周期大鼠組織中血脂相關(guān)指標(biāo)和生化指標(biāo)Table 3 Blood lipid-related indexes and biochemical indexes in rat tissues of different

2.5 不同周期大鼠血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)

對(duì)照組不同周期大鼠的血清中MDA含量逐漸升高,SOD和T-AOC有所降低,但并未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,分析認(rèn)為與動(dòng)物衰老的氧化損傷逐漸增強(qiáng)相關(guān)。而處理組動(dòng)物,自15 d開始MDA處理升高,SOD明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。T-AOC自30 d開始明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表4)。

表4 不同周期大鼠血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)的表達(dá)Table 4 Expression of oxidative stress indexes in serum of rats in different

2.6 肝病理學(xué)觀察

HE組織病理染色顯示,對(duì)照組動(dòng)物的肝組織自0 到90 d結(jié)果正常,肝竇清晰可見,細(xì)胞形態(tài)飽滿正常,細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均正常。而處理組動(dòng)物的肝組織自15 d開始,淋巴細(xì)胞聚集,肝細(xì)胞腫脹變性,細(xì)胞核擠向一側(cè),直到90 d肝索排列紊亂,肝細(xì)胞腫脹,發(fā)生脂肪變性,胞質(zhì)內(nèi)有大小不等的空泡肝血竇受壓變形等病理改變(圖1)。

注:A. 對(duì)照組(0 d),B. 對(duì)照組(90 d),C. 處理組(15 d),D. 處理組(30 d),E. 處理組(60 d),F. 處理組(90 d)。Note:A.Control group (0 d), B.Control group (90 d), C.treatment group (15 d), D.treatment group (30 d), E.treatment group (60 d),F.treatment group (90 d).

3 討論

混合型高脂飼料喂養(yǎng)是最常見的高脂血癥模型,操作較為方便,成模率也較高。本研究中混合高脂飼料除了常規(guī)的基礎(chǔ)飼料外,含有15%豬油、20%蔗糖、1.2%膽固醇和0.2%膽酸鈉。豬油主要含有飽和高級(jí)脂肪酸甘油酯,能夠影響甘油三酯的水平,補(bǔ)充體內(nèi)脂肪,促進(jìn)TG和TC的生成[9]。蔗糖在體內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化后,以糖原或脂肪的形式貯存在體內(nèi),能夠促進(jìn)體內(nèi)各種血脂成分的生成。膽固醇主要影響血清中T-CHO和LDL的水平。膽酸鈉能夠促進(jìn)大戶對(duì)膽固醇和脂肪的吸收,造成脂代謝紊亂,迫使動(dòng)物迅速形成高脂血癥。在動(dòng)物血清中,TC的水平主要受膽固醇的影響,TG水平則有豬油的比例密切相關(guān)[10]。在我們的高脂血癥模型中,高脂飼料喂養(yǎng)30 d后,大鼠血清中的TG、TC和LDL出現(xiàn)不同程度的升高,提示造模的成功。

但造模90 d后,血清中TC和TG卻出現(xiàn)明顯的下降,TG與對(duì)照組相比,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但經(jīng)肝組織勻漿后檢測(cè)血脂水平發(fā)現(xiàn),肝組織中的TC和TG升高較為明顯,且與對(duì)照組相比,差異具有學(xué)意義(P<0.05)。有文獻(xiàn)報(bào)道[11],也提出了血清中TG低于對(duì)照組的情況。高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠血脂水平在體內(nèi)呈現(xiàn)“升高-適應(yīng)-升高”的模式。有研究[12]發(fā)現(xiàn),添加膽固醇喂養(yǎng)的大鼠體內(nèi),膽固醇合成的關(guān)鍵酶羥甲基戊二酸單酰輔酶A 還 原 酶的活性下降,同時(shí)增加膽固醇值的合成,促使膽固醇值優(yōu)先向極低密度脂蛋白內(nèi)填充,導(dǎo)致肝外轉(zhuǎn)移的TG減少,造成血液中TG降低、肝中TG蓄積。這也間接證明了高脂血癥模型脂質(zhì)代謝的紊亂和復(fù)雜性?；谏洗伟l(fā)現(xiàn)和深層次的原因,建議高脂血癥動(dòng)物模型在30 d后,除了血清中血脂水平的檢測(cè),同時(shí)增加肝組織中血脂水平,肝代謝水平以及氧化應(yīng)激指標(biāo)等多方面的檢測(cè)指標(biāo),以便更科學(xué)、全面的說明問題。

高脂血癥模型是個(gè)周期較長(zhǎng)的代謝性疾病。在我們的前期研究中,同時(shí)比較了雌鼠在喂養(yǎng)高脂飼養(yǎng)后的血脂水平變化,發(fā)現(xiàn)與雄性相差甚大,故未展現(xiàn)在本研究中。專門比較雄雌大鼠喂養(yǎng)高脂飼料后血脂的代謝變化,發(fā)現(xiàn)雄性大鼠表現(xiàn)為體質(zhì)量增加合并典型的高膽固醇血癥(II a 型),而雌性大鼠主要表現(xiàn)為體質(zhì)量減低合并混合型高脂血癥(II b 型)[13]。因此,在今后的研究與分析中,應(yīng)注重雄性和雌性動(dòng)物在此方面的差異。

綜上,高脂血癥動(dòng)物模型成模率較高,但在藥物預(yù)防和治療作用的研究與分析中,應(yīng)考慮到代謝的變化和周期的長(zhǎng)短,除了血清指標(biāo)外,建議增加組織和其他代謝酶活性的檢測(cè)指標(biāo),更科學(xué)地分析藥物的作用。