匡嘉兵 郭 松 雷建平 程煜方

(武漢市第四醫(yī)院骨科,武漢 430060)

社會和經(jīng)濟的發(fā)展帶來人口老齡化的增加以及生活方式的改變,進而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥骨代謝紊亂的發(fā)病率逐年增加[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的定義,骨質(zhì)疏松癥的特征主要包括骨量的丟失和骨微結(jié)構(gòu)受到破壞。骨質(zhì)疏松性骨折往往會給老年人造成長期行動不便和各種并發(fā)癥,影響患者的生活質(zhì)量甚至生命健康[2]。因此骨質(zhì)疏松癥逐漸成為世界范圍內(nèi)的研究熱點,但目前對于骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制尚未完全明確。

微小RNA(microRNA)是單鏈非編碼RNA,包含20～22個核苷酸。microRNA通過靶向靶基因的3′UTR片段并提示其表達,被認為是多種細胞過程的潛在調(diào)節(jié)因子,如細胞增殖、凋亡和細胞分化[3]。最近的研究概述了數(shù)千個microRNA和參與調(diào)控它們的多種人類基因。許多研究證實了各種microRNA在調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松中的作用[4-8]。先前有研究表明,miR-30a-5p可通過調(diào)控RUNX2的表達,抑制成骨細胞分化[6]。miR-204通過調(diào)控Wnt信號通路影響小鼠成骨細胞分化等[7]。我們先前的研究證實,miR-494抑制骨鈣素活性,抑制成骨細胞形成礦化結(jié)節(jié),但miR-494對骨質(zhì)疏松的影響尚未有體內(nèi)實驗進行證實和研究[8]。Toll樣受體-4(TLR4)通路與影響成骨細胞的其他重要通路存在密切聯(lián)系。我們經(jīng)過先前的研究已經(jīng)證實miR-494可能調(diào)控TLR4的表達,進而抑制骨鈣素活性,抑制成骨細胞形成礦化結(jié)節(jié)[8]。

我們推測miR-494可能在骨質(zhì)疏松發(fā)病過程中起作用,并可能通過靶向TLR-4參與骨質(zhì)疏松大鼠骨髓間質(zhì)細胞的增殖、成骨分化、成脂分化等多種重要過程。為深入探究miR-494在骨質(zhì)疏松中的發(fā)病機制,通過構(gòu)建骨質(zhì)疏松大鼠模型進行體內(nèi)實驗,探究miR-494對TLR4通路的影響以及在骨質(zhì)疏松發(fā)病中的作用及機制。

1 材料和方法

1.1 材料

選取30只SPF級8周齡雌性Sprague-Dawley大鼠,購自南方醫(yī)科大學(xué)。生產(chǎn)許可證【SCXK(粵)2021-0041】,使用許可證【SYXK(鄂)2021-0114】,大鼠平均體質(zhì)量為(218.74±23.18)g。

1.2 方法

1.2.1實驗分組:將入組的大鼠隨機分為NC組(陰性對照大鼠)、OP組(骨質(zhì)疏松大鼠)、OP+miR-494 inhibitor組(骨質(zhì)疏松大鼠,miR-494抑制物注射)、OP+miR-494 inhibitor+TLR-4 vector組(骨質(zhì)疏松大鼠,miR-494抑制物和TLR-4過表達腺病毒載體注射)、OP+miR-494 inhibitor+sh TLR-4組(骨質(zhì)疏松大鼠,miR-494抑制物和TLR-4沉默腺病毒載體注射),每組6只。本研究獲得本院動物倫理委員會批準,倫理審批號:LLX20210301D。

1.2.2模型構(gòu)建:入組的NC組大鼠以每天70 mg/kg的0.9%氯化鈉溶液進行灌胃,每兩天稱量一次體質(zhì)量,連續(xù)灌胃兩周。其余組大鼠均構(gòu)建骨質(zhì)疏松大鼠模型,以每天70 mg/kg維甲酸溶液進行灌胃,連續(xù)灌胃兩周即可造模成功。麻醉后,首先從所有大鼠的腹主動脈抽取血液。每組6只大鼠通過多聚甲醛灌注固定,獲得股骨組織。

1.2.3骨標本及血液樣本采集及制備:各組大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉按照0.17 mL/100 g的標準麻醉,采集各組大鼠腹主動脈血,將腹主動脈血在3000 r/min的高速離心機中離心10 min,并獲得上清液,置于-4 ℃冰箱保存。隨后,對大鼠四肢皮膚進行初步消毒和切斷,采用斷頸法處死所有大鼠,取雙側(cè)股骨,剔除肌肉和筋膜,用生理鹽水紗布,錫紙包裹,左側(cè)用于分離BMSCs細胞,右側(cè)用于測量骨密度。

1.2.4分離BMSCs細胞和細胞培養(yǎng):取左側(cè)骨標本置于含有1%雙抗體的預(yù)先制備的PBS中。將分離的長骨切斷,過濾骨髓沖洗液,移入離心管中,離心后棄去上清液,將下層細胞重懸,培養(yǎng)細胞,培養(yǎng)3 d后更換培養(yǎng)液,然后第2天更換液體。待培養(yǎng)的細胞生長至培養(yǎng)皿的80%后,將細胞進行傳代培養(yǎng)。

1.2.5大鼠檢測指標:雙能X線吸收儀測定骨密度。ELISA檢測大鼠血清中骨鈣素(BGP)和總堿性磷酸酶(TALP)含量。

1.2.5.1骨密度測定:取右側(cè)骨標本使用多聚甲醛固定,并放置在可變系數(shù)設(shè)置為<1.0%的儀器中,雙能X線吸收儀測量股骨骨密度。肱骨密度測量完畢再次使用生理鹽水紗布,錫紙包裹,用于后續(xù)Western blot檢測。

1.2.5.2ELISA:取保存于冰箱中的血液樣本,按照ELISA試劑盒的說明,將樣品和標準品分別裝入平板中,加入生物素化抗體工作液和酶結(jié)合物工作液,并清洗平板。使用分光光度計檢測450 nm處的A值,進而檢測各組大鼠血清中BGP和TALP含量。

1.2.6細胞檢測指標:qRT-PCR檢測BMSCs細胞中miR-494和TLR4 mRNA的表達。Western blot檢測大鼠BMSCs細胞中TLR4蛋白的表達。雙熒光素酶報告基因驗證miR-494與TLR-4的靶向關(guān)系。CCK8實驗檢測各組BMSCs的增殖能力。茜素紅S染色檢測各組BMSCs成骨分化情況。油紅O染色檢測各組BMSCs成脂分化情況(圖1)。

1.2.6.1qRT-PCR:提取各組大鼠BMSCs細胞RNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA。使用20 μL反應(yīng)體系進行qRT-PCR。96 ℃預(yù)變性30 s,96 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,40個循環(huán)。TLR4 mRNA的表達以β-actin為內(nèi)參,miR-494的表達以U6為內(nèi)參計算相關(guān)基因的相對表達水平。

1.2.6.2Western blot:取各組大鼠右側(cè)股骨標本,加入蛋白裂解液,在冰上浸泡1 h,然后在3 000 r/min下離心10 min。使用BCA測定蛋白質(zhì)濃度。通過SDS-PAGE對蛋白質(zhì)進行變性和分離。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,脫脂牛奶封閉2 h,分別使用一抗和二抗進行孵育。沖洗后,通過與化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)1 min,在黑暗中充分顯影。以β-actin為內(nèi)參。

1.2.6.3雙熒光素酶報告基因驗證miR-494與TLR-4的靶向關(guān)系:構(gòu)建野生型WT-TLR-4和突變型MUT-TLR-4的3’UTR熒光素酶報告載體。利用LipofectamineTM 2000將miR-494和miR-control分別與WT-TLR-4和MUT-TLR-4共轉(zhuǎn)染BMSCs細胞,分為以下4組:miR-control和WT-TLR-4共轉(zhuǎn)染組、miR-494和WT-TLR-4共轉(zhuǎn)染組、miR-control和MUT-TLR-4共轉(zhuǎn)染組、miR-494和MUT-TLR-4共轉(zhuǎn)染組。將各組BMSCs置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h,使用雙熒光素酶報告檢測試劑盒,檢測各組細胞相對熒光素酶活性。

1.2.6.4CCK8實驗檢測各組BMSCs的增殖能力:將各組BMSCs按5×103個/孔,接種到96孔板,在37 ℃,5%CO2條件下孵育過夜。待細胞鋪板孵育過夜后,棄去原培養(yǎng)基,對不同組細胞進行轉(zhuǎn)染后,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,棄所有培養(yǎng)基,加入100 μL含有10% CCK8溶液的培養(yǎng)基,于37 ℃,5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)3 h。使用分光光度計測定A450吸光度值,計算細胞增殖活性。

1.2.6.5茜素紅S染色檢測各組BMSCs成骨分化情況:收集各組BMSCs,以1×l05個/孔 接種于6孔板,使用茜素紅S染色,根據(jù)倒置顯微鏡下觀察結(jié)果,計數(shù)礦化結(jié)節(jié)數(shù)。評價標準:茜素紅染色后鈣結(jié)節(jié)呈橘紅色;一般情況下,正常組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量多,骨質(zhì)疏松時鈣結(jié)節(jié)數(shù)量少。

1.2.6.6油紅O染色檢測各組BMSCs成脂分化情況:收集各組BMSCs,以l×l05個/孔接種于6孔板,使用油紅O染色,在倒置顯微鏡下觀察結(jié)果,計數(shù)脂肪細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠骨密度、BGP和TALP含量檢測情況

檢測各組大鼠骨密度和血清中BGP和TALP含量。和NC組大鼠相比,OP組大鼠骨密度和BGP含量顯著降低,TALP含量顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。和OP組大鼠相比,OP+miR-494 inhibitor組大鼠骨密度和BGP含量顯著升高,TALP含量顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。和OP+miR-494 inhibitor組大鼠相比,OP+miR-494 inhibitor+TLR-4 vector組大鼠骨密度和BGP含量明顯降低,TALP含量顯著升高,OP+miR-494 inhibitor+sh TLR-4組大鼠骨密度和BGP含量明顯升高,TALP含量顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠血清中BGP和TALP含量比較Table 1 Comparison of BGP and TALP contents in serum of rats in each

2.2 各組大鼠BMSCs中miR-494和TLR4的表達情況

qRT-PCR檢測各組大鼠BMSCs中miR-494和TLR4 mRNA的表達情況,Western blot檢測各組大鼠股骨組織中TLR4蛋白的表達情況。和NC組大鼠相比,OP組miR-494、TLR4 mRNA和TLR4蛋白的表達顯著升高(P<0.05)。和OP組大鼠相比,OP+miR-494 inhibitor組miR-494、TLR4 mRNA和TLR4蛋白的表達顯著降低(P<0.05)。和OP+miR-494 inhibitor組大鼠相比,OP+miR-494 inhibitor+TLR-4 vector組TLR4 mRNA和TLR4蛋白的表達顯著升高;OP+miR-494 inhibitor+sh TLR-4組TLR4 mRNA和TLR4蛋白的表達顯著降低(P<0.05)。具體結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠BMSCs中miR-494和TLR4 mRNA的表達水平比較Table 2 Comparison of the expression levels of miR-494 and TLR4 mRNA in BMSCs of rats in different

2.3 miR-494和TLR4的靶向關(guān)系驗證

根據(jù)雙熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示,miR-494和WT-TLR-4共轉(zhuǎn)染組(3.64±0.53)與miR-control和WT-TLR-4共轉(zhuǎn)染組(1.09±0.21)、miR-control和MUT-TLR-4共轉(zhuǎn)染組(1.13±0.26)、miR-494和MUT-TLR-4共轉(zhuǎn)染組(1.06±0.22)相比,熒光素酶活性顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而其他3組之間比較,熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)。

2.4 各組大鼠BMSCs的增殖能力比較

CCK8檢測各組大鼠BMSCs的增殖能力。結(jié)果顯示,和NC組相比,OP組細胞增殖能力顯著降低(P<0.05)。和OP組相比,OP+miR-494 inhibitor組細胞增殖能力顯著升高(P<0.05)。和OP+miR-494 inhibitor組相比,OP+miR-494 inhibitor+TLR-4 vector組細胞增殖能力顯著降低,OP+miR-494 inhibitor+sh TLR-4組細胞增殖能力顯著升高(P<0.05),具體結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠BMSCs的增殖情況對比Table 3 Comparison of BMSCs proliferation in different groups of

2.5 各組大鼠BMSCs成骨分化和成脂分化比較

和NC組相比,OP組細胞礦化結(jié)節(jié)數(shù)顯著減少,脂肪細胞數(shù)顯著升高(P<0.05)。和OP組相比,OP+miR-494 inhibitor組細胞礦化結(jié)節(jié)數(shù)顯著升高,脂肪細胞數(shù)顯著減少(P<0.05)。和OP+miR-494 inhibitor組相比,OP+miR-494 inhibitor+TLR-4 vector組細胞礦化結(jié)節(jié)數(shù)顯著減少,脂肪細胞數(shù)顯著升高,OP+miR-494 inhibitor+sh TLR-4組細胞礦化結(jié)節(jié)數(shù)顯著升高,脂肪細胞數(shù)顯著減少(P<0.05),具體結(jié)果見表4。

表4 細胞礦化結(jié)節(jié)數(shù)和脂肪細胞數(shù)對比Table 4 Comparison of the number of mineralized nodules and

3 討論

骨質(zhì)疏松癥現(xiàn)在被認為是老年人的常見疾病,尤其是絕經(jīng)后的老年婦女。卵巢功能退化引起的內(nèi)分泌紊亂影響骨代謝,導(dǎo)致骨脆性增加,并隨著時間的推移破壞骨組織的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。骨組織脆性的增加會導(dǎo)致受損骨骨折,進而導(dǎo)致畸形和功能喪失,嚴重時會影響心臟和肺功能。尤其是由于骨質(zhì)疏松引起的骨折和畸形,住院時間延長,嚴重影響患者的生活質(zhì)量。

microRNA可以改變破骨細胞和成骨細胞的活性。幾項臨床和臨床前研究發(fā)現(xiàn),microRNA通過影響骨吸收、破骨細胞生成活性和骨形成來改變骨重建過程。miR-494作為microRNA家族成員之一,目前在惡性腫瘤中被廣泛研究。在本研究中,qRT-PCR檢測顯示在骨質(zhì)疏松大鼠中miR-494的表達顯著升高。miR-494 inhibitor處理后,大鼠中miR-494表達顯著降低,說明miR-494 inhibitor處理大鼠,成功使骨質(zhì)疏松大鼠中miR-494表達受到抑制。miR-494被抑制后,大鼠骨密度顯著升高,血清中骨密度指標BGP含量顯著升高,TALP含量顯著降低,大鼠骨質(zhì)疏松程度明顯改善。BGP是維持骨組織正常鈣化的必需因子。TALP含量的升高可反應(yīng)骨質(zhì)疏松程度。以上結(jié)果證實miR-494在骨質(zhì)疏松中存在表達差異,并可能通過影響大鼠骨形成,降低骨密度,進而加重骨質(zhì)疏松。通過分離培養(yǎng)各組大鼠BMSCs,CCK8檢測結(jié)果顯示miR-494 inhibitor處理的大鼠BMSCs增殖能力顯著升高。同時細胞礦化結(jié)節(jié)數(shù)顯著升高,脂肪細胞數(shù)顯著減少,這表明miR-494可能是通過抑制骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和成骨分化,促進骨髓間充質(zhì)干細胞成脂分化,進而影響大鼠骨形成,降低骨密度,進而加重骨質(zhì)疏松。

目前的研究表明,Toll樣受體-4(TLR4)通路和骨質(zhì)疏松之間存在密切的聯(lián)系[9]。TLR-4信號通路可能通過影響下游轉(zhuǎn)錄因子的表達,進而影響骨形成相關(guān)蛋白的表達,并進一步抑制成骨細胞的作用。同時TLR-4信號通路可以通過抑制成骨相關(guān)標志物的表達,導(dǎo)致成骨細胞增殖受到抑制,導(dǎo)致骨細胞中礦化結(jié)節(jié)數(shù)形成減少,從而抑制成骨細胞的礦化[10-11]。先前已通過初步探究miR-494可能和TLR-4之間存在調(diào)控關(guān)系[8]。本研究通過雙熒光素酶實驗報告顯示僅miR-494和WT-TLR-4共轉(zhuǎn)染的細胞相對熒光素酶活性顯著升高,這表明miR-494對相對熒光素酶活性的影響是通過促進TLR-4表達實現(xiàn)的,因此說明miR-494和TLR-4之間存在靶向關(guān)系。對骨質(zhì)疏松大鼠進行miR-494 inhibitor和TLR-4 vector共處理,和miR-494 inhibitor單獨處理相比,大鼠骨質(zhì)疏松程度明顯加重,細胞礦化結(jié)節(jié)數(shù)顯著減少,脂肪細胞數(shù)顯著增多,成骨分化被明顯抑制,成脂分化顯著增多。miR-494 inhibitor和shTLR-4共處理和miR-494 inhibitor單獨處理的大鼠相比,可發(fā)現(xiàn)大鼠骨質(zhì)疏松程度進一步改善,細胞礦化結(jié)節(jié)數(shù)顯著增多,脂肪細胞數(shù)顯著減少,成骨分化抑制明顯減輕,成脂分化顯著減少。以上結(jié)果表明,miR-494可能通過促進TLR4通路的表達,抑制骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和成骨分化,促進骨髓間充質(zhì)干細胞成脂分化,進而影響大鼠骨形成,降低骨密度,進而加重骨質(zhì)疏松。

本研究通過構(gòu)建骨質(zhì)疏松大鼠模型并提取大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,經(jīng)過體內(nèi)實驗探究miR-494在骨質(zhì)疏松中的表達情況和調(diào)控機制,進一步完善骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制,并為臨床輔助診斷和治療骨質(zhì)疏松提供新的理論依據(jù)。本研究主要的不足之處包括未更深入探究miR-494在骨質(zhì)疏松中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),進一步完善miR-494的調(diào)控機制。