遲麗麗,王君娜,張宇名,劉 健,陳志遠(yuǎn),李樹凡,尹燕博,徐守振

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,青島 266109)

禽腺病毒(fowl adenovirus, FAdV)分為5個(gè)種(A～E),12個(gè)血清型[1]。臨床上與FAdV感染相關(guān)的主要是FAdV-4引起的心包積液綜合征(HPS)及FAdV-8b引起的包涵體肝炎(IBH),給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-4]。纖突蛋白(Fiber)是FAdV的主要結(jié)構(gòu)蛋白,能夠編碼中和抗原表位,參與體液免疫,使動(dòng)物產(chǎn)生中和抗體[5-7]。其中,FAdV-4有兩個(gè)Fiber(Fiber1和Fiber2),FAdV-8b只有一個(gè)Fiber[8-10]。Gupta等[11]研究表明重組fiber蛋白臨床保護(hù)率可達(dá)到82.7%,能夠很好地阻止包涵體肝炎的發(fā)生,對(duì)預(yù)防由FAdV-8b引起的包涵體肝炎具有很好的防制效果。Luca等[9]研究表明FAdV-8b的Fiber蛋白免疫后對(duì)子代有一定的保護(hù)效果。研究證實(shí)重組fiber2蛋白作為免疫原對(duì)FAdV-4引起的心包積液綜合征的防控具有很好的效果[12-14],可作為FAdV亞單位疫苗的候選蛋白,具有很好的應(yīng)用前景。我們前期將制備的FAdV-4和FAdV-8b單因子血清進(jìn)行細(xì)胞交叉中和試驗(yàn),結(jié)果表明FAdV-4和FAdV-8b的血清不能相互中和[15]。目前,尚未見(jiàn)有關(guān)禽腺病毒FAdV-4和FAdV-8b二價(jià)亞單位疫苗的研究,研發(fā)針對(duì)FAdV-4和FAdV-8b的二價(jià)疫苗具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本研究將FAdV-4 fiber2和FAdV-8b fiber的全長(zhǎng)蛋白、截短蛋白及二價(jià)融合蛋白成功在大腸桿菌中表達(dá),并對(duì)其免疫原性進(jìn)行了評(píng)價(jià),以期為禽腺病毒FAdV-4和FAdV-8b二價(jià)亞單位疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 主要試劑 Ⅰ群禽腺病毒FAdV-4和FAdV-8b為青島農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存;pCold-TF載體,大腸桿菌DH5ɑ、BL21(DE3),FAdV-4和FAdV-8b陽(yáng)性血清均由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存;T3 Super PCR Mix購(gòu)自北京擎科生物科技有限公司;T4 DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司;His-Tagged蛋白純化試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司;HRP標(biāo)記兔抗雞IgG抗體、7號(hào)白油、BCA蛋白濃度試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒購(gòu)自湖南艾科瑞生物工程有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 150枚SPF雞胚購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司;SPF雛雞由SPF雞胚自行孵化并在負(fù)壓隔離器中飼養(yǎng)至所需日齡。

1.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

根據(jù)FAdV-4 fiber2和FAdV-8b fiber基因序列設(shè)計(jì)截短片段(FP和BP)、融合片段(BP-FP)及全長(zhǎng)(FL和BL)引物,引物送生工生物工程有限公司合成,引物序列見(jiàn)表1。

表1 FAdV-4 fiber-2和FAdV-8b fiber基因擴(kuò)增引物Table 1 Primers of FAdV-4 fiber-2 and FAdV-8b fiber gene

以實(shí)驗(yàn)室保存的FAdV-4和FAdV-8b毒株的DNA為模板,使用FP、FL、BP、BL引物擴(kuò)增目的基因,PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收。使用BP-F和F-Linker引物、Linker-F2和FP-R引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后各取1 μL混合當(dāng)模板,使用BP-F和FP-R引物擴(kuò)增BP-FP目的基因,PCR反應(yīng)程序同上,進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收。將FP、FL、BP、BL、BP-FP回收產(chǎn)物和pCold-TF空載體用XbaⅠ和Hind Ⅲ雙酶切,用T4 DNA連接酶連接純化回收的酶切產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞,提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒,進(jìn)行酶切驗(yàn)證和測(cè)序鑒定。

1.3 重組蛋白的表達(dá)及純化

將測(cè)序正確的5個(gè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,涂布于氨芐抗性的LB平板,37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑單菌落接種于氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中,37 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)至OD600 nm為0.6左右,加入1 mol·L-1的IPTG,16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)12 h。收集表達(dá)后的菌體沉淀,冰浴超聲破碎菌體,12 000 r·min-1離心5 min,SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)情況。超聲破碎后菌體上清按照His-Tagged蛋白純化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行目的蛋白純化。

1.4 重組蛋白的Western blot鑒定

純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜,使用FAdV-4和FAdV-8b陽(yáng)性血清為一抗,HRP標(biāo)記兔抗雞IgG抗體為二抗,對(duì)純化蛋白進(jìn)行Western blot鑒定,用ECL化學(xué)發(fā)光后,凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.5 重組蛋白免疫效果評(píng)價(jià)

1.5.1 動(dòng)物分組及處理 將純化后的蛋白與油相1∶2混合。108只1日齡SPF雞隨機(jī)分成9組。1～6組(FL、FP、BP-FP4、BP-FP8b、BL、BP)為免疫組,7日齡皮下注射疫苗100 μg·只-1,14日齡進(jìn)行二免;7～8組(C4、C8b)為攻毒對(duì)照組,9組(C)為空白對(duì)照組。二免后7 d,FL、FP、BP-FP4、C4組肌肉注射FAdV-4(107.5TCID50·mL-1),BL、BP、BP-FP8b、C8b組肌肉注射FAdV-8b(107.5TCID50·mL-1),攻毒劑量為0.2 mL·只-1。在免疫前,免疫后7、14、21 d心臟采血并分離血清;攻毒后3、7 d采集攻FAdV-8b組的泄殖腔拭子;攻毒后7 d采集各組雞肝臟樣品。

1.5.2 抗體水平檢測(cè) 用間接ELISA進(jìn)行抗體水平檢測(cè),采用濃度為1 μg·mL-1的BP-FP蛋白包被過(guò)夜,用1% BSA 37 ℃封閉1 h,洗后加入1∶1 000稀釋的血清37 ℃孵育1 h,洗后加入1∶5 000稀釋的兔抗雞 IgG-HRP 37 ℃孵育1 h,洗后加入顯色液避光孵育30 min,終止顯色后讀取OD450 nm值。

1.5.3 免疫攻毒保護(hù) 攻毒后每天觀察雞的健康狀況,記錄死亡數(shù)量,計(jì)算存活率。

1.5.4 排毒量檢測(cè) 所有攻FAdV-8b的雞在攻毒3、7 d后取泄殖腔拭子置于含有抗生素的無(wú)菌生理鹽水中,提取DNA,經(jīng)qPCR檢測(cè)排毒量。根據(jù)FAdV-8b Hexon基因與其它血清型禽腺病毒差異顯著的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物,引物序列為F 5′-CTACGGCAACAGCTGGGGCAA-3′;R 5′-TGTGCAGTGGTGTCTAAC-3′,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應(yīng)體系:模板1 μL,上、下游引物各0.4 μL,2×SYBR Mix 10 μL,加水至20 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃5 s,60 ℃30 s,40個(gè)循環(huán);熔解曲線反應(yīng)條件為95 ℃10 s,65 ℃ 60 s,97 ℃1 s。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)。按照公式拷貝數(shù)(拷貝·μL-1)=6.02×1023(拷貝·mol-1)×質(zhì)粒濃度(ng·μL-1)×10-9/[(載體分子量+插入片段分子量)×660](g·mol-1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.5 細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 根據(jù)文獻(xiàn)[16-17]合成IL-4、TNF-α、IFN-γ和內(nèi)參基因β-actin引物。取攻毒7 d后所有雞的肝臟進(jìn)行研磨,提取RNA,經(jīng)RT-PCR反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以β-actin作為內(nèi)參基因經(jīng)qPCR檢測(cè)IL-4、IFN-γ和TNF-α mRNA表達(dá)水平。qPCR反應(yīng)程序同“1.5.4”。

1.6 數(shù)據(jù)分析

抗體水平、排毒量及細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平檢測(cè)數(shù)據(jù)均用Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,使用t檢驗(yàn)法進(jìn)行差異性顯著分析,P<0.05代表差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

如圖1所示,重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后,均出現(xiàn)載體片段和目的片段,FL、FP、BP-FP、BL和BP基因大小與預(yù)期一致,表明原核重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。經(jīng)測(cè)序進(jìn)一步確定重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M.相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.FL;2.FP;3.BP-FP;4.BL;5. BPM. Standard molecular weight; 1.FL; 2.FP; 3.BP-FP; 4.BL; 5.BP圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.1 Results of double digestion of recombinant expression plasmids

2.2 重組蛋白的表達(dá)及純化

經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè),結(jié)果如圖2A所示,成功表達(dá)出大小為104.9、70.6、92.3、100.3 和69.2 ku的重組蛋白,且均在上清中以可溶性形式表達(dá)。將BP-FP、BL、BP、FL 和FP蛋白上清用蛋白純化試劑盒純化,純化后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖2B)。

M.標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量;1.BL沉淀;2.BL上清;3.BP沉淀;4.BP上清;5.BP-FP上清;6.BP-FP沉淀;7.FL上清;8.FL沉淀;9.FP上清;10.FP沉淀;11.FP;12.FL;13.BP-FP;14.BL;15.BPM. Standard molecular weight; 1.BL precipitation; 2.BL supernatant; 3.BP precipitation; 4.BP supernatant; 5.BP-FP supernatant; 6.BP-FP precipitation; 7.FL supernatant; 8.FL precipitation; 9.FP supernatant; 10.FP precipitation; 11.FP; 12.FL; 13.BP-FP; 14.BL; 15.BP圖2 各樣品中重組蛋白(A)及其純化后(B)的 SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant proteins in each sample (A) and their purified proteins (B)

2.3 重組蛋白的Western blot鑒定

重組蛋白Western blot鑒定結(jié)果如圖3,FP、FL、BP-FP、BP、BL蛋白條帶大小分別為69.2、100.3、92.3、70.6、104.9 ku,與預(yù)期大小一致,表明重組蛋白在原核系統(tǒng)中成功表達(dá)。

A.FAdV-4陽(yáng)性血清作一抗;B.FAdV-8b陽(yáng)性血清作一抗;M.標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量;A1～A3.FP、FL和BP-FP;B1～B3.BP、BL和BP-FPA. FAdV-4 positive serum as primary antibody; B. FAdV-8b positive serum as primary antibody;M.Standard molecular weight; A1-A3.FP, FL, and BP-FP; B1-B3.BP, BL, and BP-FP圖3 重組蛋白的Western blotFig.3 Western blot of recombine protein

2.4 重組蛋白免疫效果評(píng)價(jià)

2.4.1 抗體水平檢測(cè) ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果如圖4所示,BL、FL、BP-FP、BP和FP組在免疫后7～14 d各組抗體均呈上升趨勢(shì),免疫后14～21 d抗體水平?jīng)]有明顯變化,免疫組抗體水平顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.05),但免疫組抗體水平無(wú)顯著差異(P>0.05)。

“**”表示差異顯著,無(wú)標(biāo)注表示差異不顯著。下同“**”means significant difference, and no mark means insignificant difference. The same as below圖4 雞免疫后血清抗體水平Fig.4 Serum antibody levels of chickens after immunization

2.4.2 免疫攻毒保護(hù) 攻毒后各組SPF雞的存活情況如圖5所示,C4組存活率為25%,BP-FP4組存活率為58.3%,其它組雞存活率均為100%。

圖5 攻毒7 d后雞存活率Fig.5 Survival rate of chickens at 7 d post-challenge

2.4.3 排毒量測(cè)定 以log(X)為X軸,Ct值為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果如圖6,標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-2.956 1x+38.826,R2=0.99。

圖6 FAdV-8b實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 The standard curve for Real-time PCR of FAdV-8b

排毒量檢測(cè)結(jié)果如圖7,在攻毒3、7 d后,C8b組排毒量分別為9.48×105和3.24×107拷貝·μL-1, BL、BP和 BP-FP8b 組排毒量顯著低于C8b組(P<0.05)。攻毒后7 d BL和BP組排毒量分別為6.4×105和1.1×106拷貝·μL-1,顯著低于BP-FP8b組(P<0.05),BP與BL組之間差異不顯著(P>0.05)。

圖7 FAdV-8b攻毒后泄殖腔拭子排毒量Fig.7 Viral loads of cloacal swabs challenged with FAdV-8b

2.4.4 細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平測(cè)定 qPCR檢測(cè)肝臟中IL-4、IFN-γ和TNF-α mRNA表達(dá)水平,結(jié)果如圖8。免疫組細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平均顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.05),FP組IL-4和IFN-γ mRNA表達(dá)水平分別為5.7和8.5,顯著高于FL組(P<0.05);BP組IL-4 mRNA表達(dá)水平為10.4,顯著高于BL組(P<0.05);BL組和BP組TNF-α mRNA表達(dá)水平分別為5.73和4.45,二者差異不顯著(P>0.05)。

A～C.不同免疫組FAdV-4攻毒;D～F.不同免疫組FAdV-8b攻毒A-C. Different immune groups post FAdV-4 challenge; D-F. Different immune groups post FAdV-8b challenge圖8 各免疫組攻毒后細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平Fig.8 mRNA expression level of cytokines in different immune groups post challenge

2.4.5 肝臟組織病理觀察 肝臟病理組織切片如圖9所示,C4組肝細(xì)胞嚴(yán)重充血、水腫,肝細(xì)胞空泡變性、壞死,存在嗜堿性包涵體和嚴(yán)重的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),C8b組肝細(xì)胞中存在包涵體和大量空泡變性。C組無(wú)病變。FL組與BL組未見(jiàn)明顯空泡變性,無(wú)炎性灶。FP組與BP組有輕微炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。BP-FP4與BP-FP8b組肝細(xì)胞能觀察到輕微空泡變性。

A.FL組;B.FP組;C.BP-FP4組;D:BL組;E.BP組;F.BP-FP8b組;G.C4組;H.C8b組;I.C組A. FL group; B. FP group; C. BP-FP4 group; D: BL group; E. BP group; F. BP-FP8b group; G. C4 group; H. C8b group; I. C group圖9 肝組織病理觀察(100×)Fig.9 Histopathological observation in liver (100×)

3 討 論

近年來(lái),由FAdV-4引起的HPS和FAdV-8b引起的IBH在肉雞中有流行暴發(fā)趨勢(shì)[18-21],給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。不同血清型FAdV混合感染的情況在養(yǎng)殖場(chǎng)普遍存在。疫苗是防控疫病的有效手段之一,目前我國(guó)還未有同時(shí)防控HPS和IBH的商品化疫苗,研制防控FAdV-4和FAdV-8b的二價(jià)疫苗具有重要意義[22-24]。

本研究通過(guò)軟件分析得到FAdV-4 fiber2和FAdV-8b fiber親水性和抗原性較好的區(qū)域位于后半段,與knob-s區(qū)域所在位置一致。因此選取了fiber2基因片段850～1 440 bp和fiber基因片段937～1 566 bp,并通過(guò)(GGGGS)315個(gè)氨基酸的linker串聯(lián)表達(dá)。5種重組蛋白均能在上清液中穩(wěn)定可溶表達(dá),避免了包涵體復(fù)性對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響。BP和FP的表達(dá)量明顯高于BL和FL,表明截短的蛋白比全長(zhǎng)蛋白更易表達(dá),這可能與所選基因片段的長(zhǎng)度有關(guān),這些結(jié)果與Fingerut等[25]研究結(jié)果一致。本研究基于大腸桿菌表達(dá)的FL、FP、BP-FP、BL、BP 5個(gè)蛋白制備了亞單位疫苗,攻毒免疫保護(hù)顯示,除BP-FP4組存活率為58.3%,其它組存活率均為100%;肝臟病理切片觀察發(fā)現(xiàn),攻毒組肝臟病變最嚴(yán)重,FP組與BP組次之,FL組與BL組無(wú)明顯病變,表明截短蛋白和全長(zhǎng)蛋白免疫保護(hù)效果優(yōu)于二價(jià)融合蛋白。FAdV-8b泄殖腔拭子排毒量結(jié)果顯示,BP-FP8b排毒量顯著高于BL和BP,但仍顯著低于FAdV-8b攻毒對(duì)照組,表明BP-FP重組蛋白的保護(hù)效果弱于單價(jià)蛋白。BP-FP4組的存活率為58.3%,低于單價(jià)蛋白,但高于對(duì)照組,表明BP-FP重組蛋白可誘導(dǎo)一定程度的免疫保護(hù)。

間接ELISA法檢測(cè)重組蛋白免疫后雞的抗體水平,具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[26-27]。5種重組蛋白均能有效誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng),僅經(jīng)過(guò)首免即可獲得較高水平的抗體,具有良好的免疫原性。與對(duì)照組相比,5種重組蛋白抗體水平均顯著升高,免疫組在受免后14 d血清抗體水平下降,與第二次免疫后抗體水平相似?？贵w水平達(dá)到峰值后,依次為FL>FP>BP-FP>BL>BP, BL組與BP組差異不顯著。由此可見(jiàn),全長(zhǎng)蛋白刺激SPF雞產(chǎn)生抗體的能力優(yōu)于截短蛋白,這可能與全長(zhǎng)蛋白具有其他重要的表位有關(guān)。Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ和TNF-ɑ等細(xì)胞因子,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫,介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答;Th2細(xì)胞主要分泌IL-4和IL-10,可以激活B細(xì)胞,促進(jìn)中和抗體的產(chǎn)生[28-29]。研究表明,FAdV-4滅活苗可刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生較高水平的IL-4和IFN-γ且顯著高于陰性對(duì)照組[30]。本研究結(jié)果顯示,免疫組均顯著高于陰性對(duì)照組,表明全長(zhǎng)蛋白、截短蛋白和二價(jià)融合蛋白均能誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫,FP組IL-4和IFN-γ mRNA表達(dá)水平顯著高于FL組,表明FP蛋白刺激機(jī)體產(chǎn)生IL-4和IFN-γ的水平高于FL蛋白。

4 結(jié) 論

FAdV-4 fiber2和FAdV-8b fiber截短蛋白和全長(zhǎng)蛋白免疫保護(hù)效果優(yōu)于二價(jià)融合蛋白,截短蛋白可替代全長(zhǎng)蛋白用于禽腺病毒亞單位疫苗的制備。