劉佳林，鞏秀美，冷 鵬，劉 林*，張桂芝*

（1.臨沂大學(xué)藥學(xué)院，山東臨沂 276005；2.臨沂市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東臨沂 276005）

胞間連絲是植物調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、發(fā)育所不可缺少的細(xì)胞器[1]。植物細(xì)胞被細(xì)胞壁包圍，胞間連絲橫跨細(xì)胞壁，提供了細(xì)胞間的分子交流通道，將植物體細(xì)胞的原生質(zhì)體連接在一起而形成共質(zhì)體，使植物體各部分在生長(zhǎng)、發(fā)育和對(duì)環(huán)境因子響應(yīng)過(guò)程中相互協(xié)調(diào)[1]。透射電鏡觀察胞間連絲基本結(jié)構(gòu)，胞間連絲是橫穿細(xì)胞壁的管道，管道由質(zhì)膜圍成，平均直徑約50 nm；管道中央是一條由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特化而成、直徑約10 nm 的細(xì)管，稱連絲小管，連絲小管與細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)連成一體[2-3]。胞間連絲可分為中央洞區(qū)和兩末端頸區(qū)，中央洞區(qū)直徑較大，末端頸區(qū)直徑較小。頸區(qū)細(xì)胞壁向管道延伸，形成頸箍；有時(shí)胼胝質(zhì)在頸區(qū)積累，能調(diào)節(jié)胞間連絲的通透性[3]。按照是否發(fā)生分支以及生成時(shí)期，胞間連絲可分為簡(jiǎn)單胞間連絲、分支胞間連絲和次生胞間連絲，簡(jiǎn)單胞間連絲沒(méi)有分支，分支胞間連絲有一個(gè)或多個(gè)分支，次生胞間連絲是細(xì)胞成熟后才開始產(chǎn)生的細(xì)胞壁[3]。研究植物葉片內(nèi)的胞間連絲類型和分布對(duì)植物分類和鑒定有一定意義。此外，葉片中的胞間連絲與韌皮部裝載關(guān)系密切，影響植物對(duì)裝載機(jī)制的選擇。韌皮部裝載是葉肉細(xì)胞合成的蔗糖進(jìn)入韌皮部伴胞的過(guò)程，是光合產(chǎn)物向其他器官轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟[4]。蔗糖進(jìn)入韌皮部伴胞的途徑分為共質(zhì)體途徑和質(zhì)外體途徑，前者的前提是伴胞細(xì)胞壁上有高密度胞間連絲，蔗糖經(jīng)過(guò)胞間連絲進(jìn)入伴胞[4-5]，后者則不需要胞間連絲，蔗糖通過(guò)蔗糖泵進(jìn)入伴胞。因此，了解伴胞壁上的胞間連絲有助于了解韌皮部裝載途徑。

南瓜是常見的藥食兩用植物，而關(guān)于南瓜葉片胞間連絲的研究極少見，胞間連絲的數(shù)量和類型與光合產(chǎn)物的運(yùn)輸關(guān)系密切，光合產(chǎn)物運(yùn)輸又與南瓜產(chǎn)量有密切的聯(lián)系，因此，采用透射電子顯微技術(shù)對(duì)南瓜葉片韌皮部胞間連絲進(jìn)行觀察，研究結(jié)果能為南瓜育種工作提供超微水平上的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試南瓜（Cucurbitamoschata(Duch.ex Lam.)Duch.ex Poiret）種子源自臨沂市種子公司，種植于臨沂大學(xué)校園內(nèi)。2020年和2021年每年7月從生長(zhǎng)良好的植株上取樣。

1.2 儀器與設(shè)備

超薄切片機(jī)，LEICA ULTRACUT R，德國(guó)徠卡公司；透射電子顯微鏡，JEM-2100，日本電子株式會(huì)社。

1.3 方法

取充分?jǐn)U展的成熟葉，將葉片切成小塊，置于2%戊二醛溶液中初固定12 h，再于1%四氧化鋨溶液中后固定4 h。梯度乙醇脫水，Epon-812 環(huán)氧樹脂包埋。用超薄切片機(jī)切片，半薄切片厚度1 μm，甲苯胺藍(lán)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察葉片顯微結(jié)構(gòu)[6]。超薄切片厚度70 nm，醋酸雙餅鈾和檸檬酸鉛進(jìn)行電子染色[7]，透射電子顯微鏡下觀察胞間連絲。

2 結(jié)果與分析

2.1 南瓜葉片的基本結(jié)構(gòu)

如圖1所示，南瓜葉片由表皮、葉肉和葉脈組成。上表皮細(xì)胞較下表皮細(xì)胞略大，葉肉分化為2 層細(xì)胞的柵欄組織和海綿組織，柵欄組織厚約80 μm，海綿組織厚約40 μm；小葉脈僅含維管束，維管束由4～5 個(gè)細(xì)胞線狀排列的木質(zhì)部和球形韌皮部組成，頭部中央是篩管，伴胞圍繞著篩管。維管束基本位于柵欄組織中。圍繞維管束的葉肉細(xì)胞構(gòu)成維管束鞘，與木質(zhì)部相連的維管束鞘細(xì)胞是柵欄細(xì)胞，與韌皮相連的維管束鞘細(xì)胞是海綿細(xì)胞，木質(zhì)部側(cè)面的維管束鞘細(xì)胞末端與韌皮部伴胞相連。

圖1 南瓜葉片橫切面Fig.1 Transverse section of pumpkin leaf blade

2.2 不同界面胞間連絲的類型與分布

如圖2A所示，表皮細(xì)胞（壁左側(cè)）與葉肉細(xì)胞（壁右側(cè)）界面上的壁厚約0.3 μm，壁上存在胞間連絲，表皮細(xì)胞側(cè)的胞間連絲數(shù)較少，葉肉細(xì)胞側(cè)胞間連絲較多，但葉肉細(xì)胞側(cè)的胞間連絲都與表皮側(cè)的胞間連絲相連，因此表皮與葉肉界面上的胞連絲為分支胞間連絲。胞間連絲末端伸出細(xì)胞壁外，壁外的部分較細(xì)（細(xì)長(zhǎng)箭頭），為胞間連絲的頸部，而壁內(nèi)部分略粗（粗箭頭），為胞間連絲的中央洞部。表皮細(xì)胞側(cè)的頸部較葉肉細(xì)胞側(cè)的頸部略粗。葉肉是進(jìn)行光合作用的同化組織，葉肉細(xì)胞壁較薄，只有0.1 μm 左右，跨越細(xì)胞壁的胞間連絲相對(duì)較短，沒(méi)有分支，均為簡(jiǎn)單胞間連絲（圖2B）。

圖2 南瓜葉片表皮細(xì)胞-葉肉細(xì)胞界面及葉肉細(xì)胞-葉肉細(xì)胞界面上的胞間連絲Fig.2 Plasmodesmata in the interfaces between epidermis and mesophyll and mesophyll and mesophyll

維管束是承擔(dān)運(yùn)輸作用的復(fù)合組織，分為木質(zhì)部和韌皮部，小葉脈的韌皮部常只含有篩管和伴胞，伴胞體積相對(duì)較大，細(xì)胞質(zhì)濃，特化為中間細(xì)胞。葉肉細(xì)胞緊密地排列在維管束周圍，這些葉肉細(xì)胞稱為維管束鞘細(xì)胞（圖3A）。伴胞與篩管界面上存在胞間連絲或孔道（圖3C～D），在伴胞一側(cè)有大量分支的胞間連絲（圖3D、E），篩管一側(cè)是孔道，大量胞間連絲匯集后與孔道相連，形成胞間連絲- 孔道復(fù)合體（圖3D、E）。

圖3 維管束以及伴胞與篩管界面上的胞間連絲Fig.3 Phloem and plasmodesmata in the interface between companion cells and sieve elements

在伴胞與葉肉細(xì)胞界面上有大量胞間連絲（圖4），胞間連絲通常在伴胞一側(cè)發(fā)生分支（圖4B），屬于分支胞間連絲。胞間連絲并不是均勻分布在細(xì)胞上，而是聚集在若干區(qū)域，區(qū)域直徑為1.5～3 μm，區(qū)域內(nèi)胞間連絲密度較高，可達(dá)122 個(gè)/μm2?？梢姲g連絲的結(jié)構(gòu)，質(zhì)膜圍成筒，筒中央有連絲小管（圖4B、D）。胞間連絲末端可見有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與其相連（圖4A）。

圖4 伴胞與葉肉細(xì)胞界面上的胞間連絲Fig.4 Plasmodesmata in the interface between companion the companion cell and the mesophyll cell

3 討論與結(jié)論

3.1 不同細(xì)胞界面上胞間連絲類型的差異為認(rèn)識(shí)南瓜葉提供了新視角

南瓜葉片含有不同類型的細(xì)胞，不同類型細(xì)胞界面上的胞間連絲類型不同。本研究表明，南瓜葉片不同界面上有不同類型的胞間連絲，表皮細(xì)胞與葉肉細(xì)胞界面、葉肉細(xì)胞與伴胞界面以及伴胞與篩管界面上都有分支胞間連絲，以伴胞與篩管界面上的胞間連絲分支最多，其次是表皮細(xì)胞與葉肉細(xì)胞界面及葉肉細(xì)胞與伴胞界面上的胞間連絲。在葉肉與伴胞界面上，不僅有分支胞間連絲，也有簡(jiǎn)單胞間連絲。在葉肉細(xì)胞與葉肉細(xì)胞界面上，則只有簡(jiǎn)單胞間連絲。顯然，胞間連絲的類型與界面的類型有關(guān)。值得注意的是，在伴胞與篩管界面上，由伴胞產(chǎn)生的細(xì)胞壁上才有胞間連絲，分支發(fā)生在細(xì)胞壁較靠外的位置。在篩管產(chǎn)生的細(xì)胞壁上，胞間連絲失去了根本性結(jié)構(gòu)特征，缺少連絲小管，成為僅由質(zhì)圍成的孔道，并且沒(méi)有分支。篩管側(cè)胞間連絲變化成孔道的過(guò)程可能與篩管的發(fā)育有關(guān)，篩管分子產(chǎn)生后不久就發(fā)生細(xì)胞質(zhì)退化，丟失細(xì)胞核、核糖體等細(xì)胞器[8]，這些細(xì)胞器可能參與胞間連絲結(jié)構(gòu)的維持，一旦失去這些細(xì)胞器，細(xì)胞便可能失去維持胞間連絲完整結(jié)構(gòu)的能力。不同植物葉片胞間連絲類型及其分布特點(diǎn)是否相同，還有待進(jìn)一步觀察。南瓜葉片內(nèi)不同界面上胞間連絲發(fā)育模式不同，這一特征為從超微水平上認(rèn)識(shí)南瓜葉片提供了新視角。

3.2 葉肉細(xì)胞與伴胞界面上高密度胞間連絲表明南瓜韌皮部裝載涉及共質(zhì)體途徑

研究為認(rèn)識(shí)南瓜韌皮部裝載提供了超微水平上的參考。本研究結(jié)果表明，南瓜葉肉細(xì)胞與伴胞界面上胞間連絲極為豐富，不是均勻分布于細(xì)胞壁上，而是聚集在某些區(qū)域，區(qū)域內(nèi)多達(dá)120 個(gè)/μm2。如此豐富的胞間連絲構(gòu)成了葉肉與伴胞間巨大的共質(zhì)通道系統(tǒng)，從而為細(xì)胞間運(yùn)輸提供了便利。葉肉細(xì)胞與伴胞間的運(yùn)輸主要是光合產(chǎn)物的運(yùn)輸，從葉肉到伴胞的光合產(chǎn)物運(yùn)輸稱為韌皮部裝載，是葉肉細(xì)胞生產(chǎn)的光合產(chǎn)物以及由其衍生的其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、糖醇等向葉外運(yùn)輸?shù)钠瘘c(diǎn)[4-5]。蔗糖進(jìn)入韌皮部的機(jī)制有三種[9]，其中兩種涉及共質(zhì)體途徑，另一種涉及質(zhì)外體途徑[10-11]。涉及共質(zhì)體途徑的第一種機(jī)制是在葉肉細(xì)胞與伴胞之間的界面上有高密度的胞間連絲，兩種細(xì)胞之間存在蔗糖濃度梯度，葉肉細(xì)胞中蔗糖濃度高，伴胞中蔗糖濃度低，這一濃度梯度是運(yùn)輸動(dòng)力，驅(qū)動(dòng)蔗糖通過(guò)胞間連絲向伴胞運(yùn)輸，實(shí)現(xiàn)蔗糖的韌皮部裝載[12-13]。涉及共質(zhì)體途徑的另一種機(jī)制是葉肉細(xì)胞與伴胞界面上有高密度胞間連絲，蔗糖從葉肉細(xì)胞通過(guò)胞間連絲擴(kuò)散進(jìn)入伴胞，在伴胞內(nèi)轉(zhuǎn)化成水蘇糖、棉籽糖等寡糖，從而維持葉肉細(xì)胞與伴胞之間蔗糖濃度梯度，寡糖進(jìn)入篩管而不能返回葉肉細(xì)胞，這一機(jī)制稱為多聚體陷阱[14]。涉及質(zhì)外體途徑的機(jī)制則不同，葉肉細(xì)胞與伴胞界面上沒(méi)有或極少有胞間連絲，蔗糖通過(guò)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白離開葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體而進(jìn)入細(xì)胞壁中的微空間，再由伴胞質(zhì)膜上蔗糖泵將其泵入伴胞，蔗糖泵的工作需要質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)提供能量[15]。有研究表明，葫蘆科植物韌皮部汁液含有高濃度棉子糖，以寡糖而不是蔗糖運(yùn)輸光合產(chǎn)物[16]，而本研究表明南瓜葉肉細(xì)胞與伴胞界面上有大量胞間連絲，綜合本研究結(jié)果和文獻(xiàn)資料表明，南瓜韌皮部裝載機(jī)制為多聚體陷阱。韌皮部胞間連絲的分布密度可為南瓜育種工作提供超微水平上的參考。