吳海濤, 李紅凈, 苗艷麗, 周海靜, 張 曼

慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是由心室供血不足或充盈力低下引起組織器官血流灌注不足的心血管疾病終末期表現(xiàn),其發(fā)病率、致殘率以及致死率較高[1]。心房顫動(atrial fibrillation,AF)為嚴重的心房電活動紊亂,其發(fā)病率隨年齡增長而上升[2]。CHF與AF可同時存在,兩者既互為因果又相互促進[3]。目前,CHF患者合并AF的發(fā)病機制尚不明確,因此尋找可預測CHF患者發(fā)生AF風險的生物標志物具有重要意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類長度超過200 nt的功能性RNA分子,無蛋白質編碼功能,可參與早期胚胎發(fā)育、細胞增殖與凋亡、基因調節(jié)等一系列生命活動,以及冠脈粥樣硬化、CHF等心血管疾病發(fā)病過程[4]。lncRNA ROR位于人類染色體18q21.31,對細胞重編程過程具有重要調控作用,能誘導多能干細胞形成[5]。研究指出,心肌細胞中的lncRNA ROR水平上調,以MR-145/Hax-1軸為靶點誘導心肌細胞缺氧損傷,引起心肌肥大[6]。微小核糖核酸(micro ribonucleic acid,miRNA)為內(nèi)源性非編碼RNA,具有調控基因、蛋白質表達等功能,部分miRNA能調控心肌細胞、成纖維細胞的增殖、分化、凋亡過程,在心血管疾病的病理生理過程中發(fā)揮重要作用[7]。研究顯示,miR-145可促進心臟成纖維細胞分化為肌成纖維細胞,修復梗死后的心肌細胞,其表達缺失可誘導血管平滑肌細胞發(fā)生惡性生物學行為,與心血管疾病發(fā)生有關[8]。目前l(fā)ncRNA ROR和miR-145表達水平與CHF患者發(fā)生AF的關聯(lián)性研究鮮有報道。鑒此,本研究通過檢測CHF患者血清lncRNA ROR與miR-145的表達水平,探討兩者與AF發(fā)生的關系,為預測CHF患者發(fā)生AF風險提供新的生物標志物。

1 對象與方法

1.1研究對象 招募2019年3月至2022年12月邯鄲市第一醫(yī)院收治的108例CHF患者,其中男61例,女47例;年齡51～75(64.52±4.18)歲;CHF病程3～15(7.15±2.06)年;紐約心臟病協(xié)會(New York Heart Association,NYHA)心功能分級:Ⅱ級37例,Ⅲ級46例,Ⅳ級25例;合并基礎疾病:高血壓42例,糖尿病34例,高脂血癥24例。納入標準:(1)符合《慢性心力衰竭中西醫(yī)結合診療專家共識》[9]中關于CHF的診斷標準,且經(jīng)心電圖、超聲等影像學檢查確診;(2)符合《慢性心力衰竭合并心房顫動診斷與治療中國專家共識》[10]中關于AF的診斷標準;(3)NYHA心功能分級為Ⅱ～Ⅳ級;(4)臨床資料完整。排除標準:(1)合并自身免疫性疾病者;(2)合并嚴重感染者;(3)合并惡性腫瘤者;(4)有心臟外科手術史、AF發(fā)病史者;(5)妊娠與哺乳期婦女;(6)合并嚴重肝腎功能障礙者;(7)合并血栓栓塞疾病者。根據(jù)入院時AF發(fā)生情況將CHF患者分為合并AF組(n=46)和未合并AF組(n=62)。于同期納入本院健康體檢者50名作為對照組,其中男28名,女22名;年齡52～78(65.03±4.62)歲。健康體檢者與CHF患者的性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究獲邯鄲市第一醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(批號:2019-0226),研究對象簽署知情同意書。

1.2一般資料收集 通過醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)收集CHF患者性別、年齡、CHF病程、NYHA心功能分級、合并基礎疾病(高血壓、糖尿病、高脂血癥)、吸煙史、飲酒史等資料。

1.3實驗室檢查 以抗凝試管采集CHF患者入院次日清晨空腹肘靜脈血10 ml,健康體檢者于體檢當日采集,其中5 ml血液標本以3 000 r/min離心15 min,收集血清,-80 ℃保存?zhèn)錂z。另外5 ml血液標本用于檢測總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)等生化指標水平,所用儀器為日立公司7060全自動生化分析儀。

1.4心功能檢查 入院當日使用美國GE Vivid7超聲診斷儀檢測CHF患者的左房內(nèi)徑(left atrial diameter,LAD)、左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end systolic diameter,LVESD)等心功能指標。

1.5血清lncRNA ROR、miR-145表達水平檢測 應用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測血清lncRNA ROR、miR-145表達水平。采用Trizol法提取血清總RNA,應用反轉錄試劑盒(日本Takara公司)將其反轉錄為cDNA,并以cDNA為模板進行qRT-PCR。反應條件:95 ℃預變性10 min,95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,變性退火延伸共40個循環(huán)。反應體系:SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl,cDNA 2.0 μl,上、下游引物各0.8 μl,ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μl,ddH2O 6.0 μl。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計與合成,引物序列見表1。以GAPDH為內(nèi)參,通過2-△△Ct法計算血清中l(wèi)ncRNA ROR、miR-145的相對表達量。

表1 引物序列

2 結果

2.1兩組臨床資料比較 兩組患者的性別、年齡、CHF病程、基礎疾病、吸煙史、飲酒史、TC、TG、LDL-C、HDL-C、FPG比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。合并AF組LAD、LVEDD以及LVESD高于未合并AF組,LVEF低于未合并AF組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組患者NYHA心功能分級比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組臨床資料比較

2.2三組血清lncRNA ROR、miR-145表達水平比較 未合并AF組、合并AF組lncRNA ROR表達水平高于對照組,且合并AF組高于未合并AF組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。未合并AF組、合并AF組miR-145水平低于對照組,且合并AF組低于未合并AF組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 三組血清lncRNA ROR、miR-145表達水平比較

2.3血清lncRNA ROR、miR-145表達水平與心功能指標的相關性分析結果 Pearson相關性分析結果顯示,血清lncRNA ROR表達水平與LAD、LVEDD、LVESD呈正相關(P<0.05),與LVEF呈負相關(P<0.05);miR-145表達水平與LAD、LVEDD、LVESD呈負相關,與LVEF呈正相關(P<0.05)。見表4。

表4 血清lncRNA ROR、miR-145表達水平與心功能指標的相關性分析結果

2.4影響CHF患者發(fā)生AF的多因素logistic回歸分析結果 以CHF患者合并AF情況(未合并AF=0,合并AF=1)為因變量,以NYHA心功能分級、LAD、LVEF、LVEDD、LVESD及血清lncRNA ROR、miR-145表達水平為自變量進行多因素logistic回歸分析,結果顯示,NYHA心功能分級Ⅳ級、LVEF下降、lncRNA ROR水平上調是促進CHF患者AF發(fā)生的獨立危險因素(P<0.05),而miR-145水平上調是抑制CHF患者AF發(fā)生的獨立保護因素(P<0.05)。見表5。

表5 影響CHF患者發(fā)生AF的多因素logistic回歸分析結果

2.5血清lncRNA ROR、miR-145表達水平對CHF患者AF發(fā)生的預測價值 ROC曲線分析結果顯示,血清lncRNA ROR、miR-145表達水平能有效預測CHF患者AF發(fā)生,且兩者聯(lián)合的預測效能更優(yōu)[AUC(95%CI)=0.814(0.730～0.897),P<0.001]。見表6,圖1。

圖1 血清lncRNA ROR、miR-145表達水平預測CHF患者發(fā)生AF的ROC曲線圖

表6 血清lncRNA ROR、miR-145表達水平預測CHF患者AF發(fā)生的ROC曲線分析結果

3 討論

3.1CHF主要由心肌炎、高血壓等疾病引起,易合并呼吸衰竭、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病,嚴重情況下可引起死亡,其發(fā)病率呈上升趨勢[1]。AF是一種常見且較為嚴重的心律失常,其發(fā)病率隨年齡的增長而上升。研究顯示,心室重構是CHF進展的病理基礎,也是導致室性心律失常的結構基礎[11]。CHF與AF可同時存在,AF發(fā)生時會造成心房收縮功能喪失,心率長期處于高頻率狀態(tài)可導致心力衰竭。心力衰竭發(fā)生時心臟的泵血功能減弱,心房中血液淤積而出現(xiàn)纖維化,其傳導與興奮性不一致可導致AF發(fā)生[12-13]。CHF患者合并AF的病死率高于單一疾病患者,但兩者同時發(fā)病的作用機制尚不明確。因此,尋找血清生物標志物以預測CHF患者AF的發(fā)生風險已成為臨床研究熱點。

3.2lncRNA是位于細胞核或細胞漿中的功能性RNA分子,可在真核細胞中轉錄,但其無法編碼蛋白質[14]。研究顯示,部分lncRNA在心肌組織中表達,對心肌細胞凋亡、心室重構等具有特異性,說明lncRNA在心血管疾病進展中發(fā)揮重要作用[15]。lncRNA ROR位于染色體18q21.31,可通過與異質核核糖核蛋白I(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein I,hnRNPI)作用以調控DNA損傷后細胞p53的表達,抑制氧化應激,誘導細胞凋亡[16]。既往研究指出,在小鼠心力衰竭的肥大心肌細胞中l(wèi)ncRNA ROR表達水平上升,提示lncRNA ROR可能促使肥大心肌細胞缺血、缺氧并參與心力衰竭發(fā)生發(fā)展過程[17]。本研究結果顯示,合并AF組、未合并AF組血清lncRNA ROR表達水平高于對照組,且合并AF組更高,導致該結果的原因可能是lncRNA ROR對心肌肥厚的發(fā)生與進展具有促進作用,進而參與CHF發(fā)生發(fā)展過程[18]。miRNA為非編碼RNA,細胞與組織特異性較高,與心血管疾病進展有關。miR-145位于染色體5q32-33,多表達于心肌細胞和血管平滑肌中,能維持平滑肌的穩(wěn)定性[19]。研究顯示,miR-145能抑制鈣離子磷酸化及鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ介導的信號,調節(jié)凋亡信號通路以及激酶1/核因子p65抗炎途徑,進而減輕心肌缺血再灌注誘導的炎癥與氧化反應,對心肌細胞的電生理具有穩(wěn)定作用,減少心肌細胞凋亡[20]。本研究中CHF患者的血清miR-145表達水平下調,且合并AF組水平更低,提示miR-145參與CHF患者AF發(fā)生。其原因可能是miR-145能激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)信號通路從而下調凋亡基因的表達,對心肌細胞凋亡具有抑制作用。當miR-145表達缺失可減弱對心肌細胞的保護作用,導致心肌損傷[21]。

3.3lncRNA ROR與miR-145相互作用,可作為協(xié)同調節(jié)因子[22]。本研究結果顯示,血清lncRNA ROR表達水平與LAD、LVEDD、LVESD呈正相關,與LVEF呈負相關;miR-145表達水平與LAD、LVEDD、LVESD呈負相關,與LVEF呈正相關,提示血清lncRNA ROR、miR-145均與患者心功能有關,lncRNA ROR水平上調、miR-145水平下調可造成CHF患者心功能下降,對AF發(fā)生有促進作用。本研究發(fā)現(xiàn),NYHA心功能分級Ⅳ級、LVEF下降、lncRNA ROR水平上調是促進CHF患者AF發(fā)生的獨立危險因素,而miR-145水平上調是抑制CHF患者AF發(fā)生的獨立保護因素。NYHA心功能分級和LVEF均是評估心功能的重要指標,NYHA心功能分級等級越高,表示患者心功能越差,LVEF下降表示患者心功能降低,增加CHF患者AF發(fā)生的風險。lncRNA ROR水平在缺氧條件下以時間依賴方式上調,過表達可挽救缺氧誘導的細胞活性抑制與細胞凋亡,低氧誘導的lncRNA ROR水平上調降低了細胞對低氧反應下的保護機制。miR-145過表達可減弱lncRNA ROR對低氧誘導的保護作用,lncRNA ROR的抗缺氧作用可能是lncRNA ROR通過抑制miR-145激活RAS蛋白/RAF蛋白/絲裂原活化細胞外信號調節(jié)蛋白激酶/核因子-κB和PI3K/AKT信號通路,以保護心肌細胞免受缺氧引起的損害[23]。ROC曲線分析結果顯示,血清lncRNA ROR、miR-145單獨及聯(lián)合預測AF的AUC分別為0.699、0.750、0.814,表明lncRNA ROR、miR-145對CHF患者AF發(fā)生具有較高的預測價值,且兩者聯(lián)合的預測價值更高,說明這兩個指標可作為臨床早期預測CHF患者AF發(fā)生的血清生物標志物。

綜上所述,CHF患者血清lncRNA ROR、miR-145與心功能有關,兩者聯(lián)合對于CHF患者AF發(fā)生具有較高的預測價值。