李玲琴, 周睿姣, 張燕妮, 賀泓霓, 袁心柱

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性炎癥性自身免疫疾病[1],主要影響滑膜關(guān)節(jié),表現(xiàn)為滑膜微血管生成、滑膜襯里細(xì)胞增生,滑膜間質(zhì)有大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)刺激局部炎癥,若不及時(shí)治療,可能會(huì)導(dǎo)致永久性關(guān)節(jié)損傷和殘疾[2]。全世界大約每200名成年人中就有1人受RA的影響,且女性的發(fā)病率是男性的2～3倍,發(fā)病高峰期為50～59歲。據(jù)統(tǒng)計(jì),RA患者的壽命較無(wú)RA者少6～11年[3]。雖然目前RA仍無(wú)法治愈,但早期診斷和及時(shí)治療有助于減緩關(guān)節(jié)損害的進(jìn)展,提高患者的生活質(zhì)量[4]。RA的潛在發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,尋找與RA相關(guān)的發(fā)病關(guān)鍵基因并闡明其免疫機(jī)制有助于臨床提高疾病的早期診斷能力[5]。目前,基于機(jī)器學(xué)習(xí)算法的免疫浸潤(rùn)和生物信息學(xué)分析可以挖掘新的診斷標(biāo)志物,最近已應(yīng)用于許多免疫相關(guān)疾病,包括潰瘍性結(jié)腸炎、白癜風(fēng)、骨關(guān)節(jié)炎和銀屑病等[6]。鑒此,本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法從RA數(shù)據(jù)集中篩選出差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs),并進(jìn)一步聯(lián)合機(jī)器學(xué)習(xí)算法尋找最佳的RA診斷基因,并對(duì)RA可能的發(fā)病機(jī)制及免疫浸潤(rùn)機(jī)制進(jìn)行探索,為RA的早期診斷以及靶向治療研發(fā)提供參考。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)資料檢索 在基因表達(dá)綜合(Gene Expression Omnibus,GEO) 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)以“rheumatoid arthritis”為檢索詞進(jìn)行檢索。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)包含RA患者和健康對(duì)照數(shù)據(jù);(2)樣本類別為關(guān)節(jié)滑膜組織;(3)芯片的平臺(tái)信息明確。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)芯片平臺(tái)上的基因探針I(yè)D無(wú)法轉(zhuǎn)化為基因名稱;(2)下載文件中的數(shù)據(jù)不完整或無(wú)效。根據(jù)上述納入、排除標(biāo)準(zhǔn)從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇了3個(gè)基因數(shù)據(jù)集:GSE55235、GSE77298和GSE55457。將GSE55457作為獨(dú)立驗(yàn)證數(shù)據(jù)集,將GSE55235和GSE77298作為聯(lián)合芯片訓(xùn)練集。各芯片數(shù)據(jù)文件以及相應(yīng)的平臺(tái)信息見(jiàn)表1。

表1 數(shù)據(jù)集信息

1.2數(shù)據(jù)預(yù)處理 使用“Limma”R包(版本)中的“normalizeBetweenArrays”函數(shù)來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化GSE55235、GSE77298和GSE55457數(shù)據(jù)集,箱線圖用于規(guī)范化處理后的可視化。

1.3DEGs的篩選 使用R統(tǒng)計(jì)軟件中的Limma包研究聯(lián)合芯片訓(xùn)練集的DEGs。篩選DEGs的截止值:adjustedP<0.05且|logFC|≥1。

1.4DEGs富集分析 應(yīng)用R軟件的Cluster Profiler數(shù)據(jù)包對(duì)DEGs進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析,以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選。

1.5機(jī)器學(xué)習(xí)篩選診斷基因 使用支持向量機(jī)-遞歸特征消除(support vector machines-recursive feature elimination,SVM-RFE)、最小絕對(duì)值收斂和選擇算子(least absolute shrinkage and selection operator,LASSO)和隨機(jī)森林(random forest,RF)三種機(jī)器學(xué)習(xí)算法篩選診斷基因,最后取三種方法獲得診斷基因的交集。

1.6診斷基因的驗(yàn)證以及診斷效能分析 將GSE55457作為獨(dú)立的驗(yàn)證數(shù)據(jù)集,采用成組t檢驗(yàn),以P<0.05判定差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,建立受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線,計(jì)算曲線下面積(area under the curve,AUC)值,評(píng)估研究指標(biāo)診斷RA的效能。

1.7診斷模型的構(gòu)建 整合診斷基因在驗(yàn)證集數(shù)據(jù)集中的表達(dá)矩陣,使用logistic回歸分析構(gòu)建診斷模型,應(yīng)用R軟件構(gòu)建可視化的列線圖來(lái)診斷RA患者,采用ROC曲線評(píng)估模型性能。

1.8免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析 應(yīng)用xCell算法[7]計(jì)算淋巴細(xì)胞、髓系細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、干細(xì)胞以及其他免疫細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)量,并采用秩和檢驗(yàn)比較RA組與健康對(duì)照組(HC組)的表達(dá)差異,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1數(shù)據(jù)預(yù)處理結(jié)果 應(yīng)用R軟件Limma包對(duì)數(shù)據(jù)集GSE55235、GSE77298和GSE55457進(jìn)行標(biāo)化處理,批次校正后各數(shù)據(jù)集間的數(shù)據(jù)分布趨于一致。見(jiàn)圖1。

2.2DEGs分析結(jié)果 通過(guò)分析聯(lián)合芯片訓(xùn)練集中的數(shù)據(jù),總共篩選出RA組和HC組的DEGs共704個(gè),其中上調(diào)476個(gè),下調(diào)228個(gè),并將結(jié)果可視化為火山圖(圖2?)和熱圖(圖2?)。

圖2 DEGs篩選結(jié)果圖

2.3DEGs的GO富集分析和KEGG富集分析結(jié)果 GO富集分析結(jié)果顯示,DEGs主要富集于白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、免疫應(yīng)答的激活、白細(xì)胞遷移、淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。見(jiàn)圖3?。KEGG富集分析結(jié)果顯示,DEGs主要富集于趨化因子信號(hào)通路、利什曼病、RA、金黃色葡萄球菌感染等。見(jiàn)圖3?。

圖3 DEGs的GO富集分析和KEGG富集分析結(jié)果圖

2.4機(jī)器學(xué)習(xí)篩選診斷基因結(jié)果 SVM-RFE算法挑選出27個(gè)診斷基因(見(jiàn)圖4??),構(gòu)建LASSO回歸模型并進(jìn)行交叉驗(yàn)證,誤差最小值對(duì)應(yīng)17個(gè)特征基因(見(jiàn)圖4??)。RF算法鑒定了39個(gè)特征基因(見(jiàn)圖4??)。取交集得到4個(gè)診斷基因:趨化因子CXC配體13(C-X-C motif chemokine ligand 13,CXCL13)、富含亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域15(leucine rich repeat containing 15,LRRC15)、多配體蛋白聚糖-1(syndecan 1,SDC-1)和核酸結(jié)合蛋白3(Y-box binding protein 3,YBX3)。見(jiàn)圖4?。

2.5診斷基因的驗(yàn)證以及診斷效能分析 使用GSE55457芯片數(shù)據(jù)集對(duì)篩選出的4個(gè)診斷基因進(jìn)行外部驗(yàn)證,結(jié)果顯示,相對(duì)于HC組,YBX3基因表達(dá)在RA患者中顯著下調(diào)(P<0.05),而CXCL13、LRRC15和SDC-1基因表達(dá)在RA患者中顯著上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖5。這與訓(xùn)練集中的基因表達(dá)趨勢(shì)相同。ROC曲線分析結(jié)果顯示,機(jī)器算法篩選得到的4個(gè)診斷基因在驗(yàn)證數(shù)據(jù)集中對(duì)RA具有較高的診斷效能(AUC>0.8)。見(jiàn)圖6。

圖5 4個(gè)診斷基因在驗(yàn)證數(shù)據(jù)集中表達(dá)水平比較圖

圖6 驗(yàn)證數(shù)據(jù)集中4個(gè)診斷基因ROC曲線圖

2.6診斷RA的列線圖模型構(gòu)建結(jié)果 基于驗(yàn)證數(shù)據(jù)集的診斷基因表達(dá)矩陣,使用logistic回歸方法構(gòu)建診斷預(yù)測(cè)模型,并通過(guò)列線圖對(duì)模型進(jìn)行可視化。見(jiàn)圖7?。ROC曲線分析結(jié)果顯示,相對(duì)于任意一個(gè)單獨(dú)的診斷基因,組合模型對(duì)RA的診斷性能更高(AUC=0.985)。見(jiàn)圖7?。

圖7 診斷RA的列線圖模型構(gòu)建結(jié)果圖

2.7免疫浸潤(rùn)分析結(jié)果 與HC組相比,RA組B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞水平顯著上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖8。

?淋巴細(xì)胞;?髓系細(xì)胞;?基質(zhì)細(xì)胞;?干細(xì)胞和其他細(xì)胞。藍(lán)色為HC組,紅色為RA組;*P<0.05

3 討論

在本研究中,筆者對(duì)RA的基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,共鑒定出了704個(gè)DEGs。GO和KEGG富集分析結(jié)果表明,DEGs在與免疫反應(yīng)有關(guān)的生物過(guò)程中明顯富集。隨后聯(lián)合機(jī)器學(xué)習(xí)篩選出RA的診斷基因,最后得到4個(gè)診斷基因,即CXCL13、LRRC15、SDC-1和YBX3。在驗(yàn)證數(shù)據(jù)集中,ROC曲線分析結(jié)果顯示這些基因?qū)A的診斷效能較高,具有較好的臨床應(yīng)用前景。

3.1RA是一種以滑膜炎癥和進(jìn)行性關(guān)節(jié)破壞為特征的慢性全身免疫介導(dǎo)疾病[8]。B細(xì)胞在RA發(fā)生中發(fā)揮了重要作用。自身反應(yīng)性B細(xì)胞可產(chǎn)生直接參與關(guān)節(jié)損傷的IgG自身抗體[9]。CXCL13是B細(xì)胞一種關(guān)鍵的趨化因子,可通過(guò)調(diào)節(jié)局部免疫反應(yīng)和抗體產(chǎn)生而參與疾病發(fā)生。研究表明,在RA患者中CXCL13水平顯著升高[10]。不僅如此,CXCL13還可反映RA疾病的嚴(yán)重程度。Meeuwisse等[11]研究表明,RA患者CXCL13基線水平越高,其關(guān)節(jié)破壞率越高。使用阿達(dá)木單抗控制RA病情后,CXCL13水平顯著下降,而在治療中斷時(shí),CXCL13的水平上升至治療前水平[12]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示,使用抗CXCL13的多克隆抗體治療可以降低小鼠關(guān)節(jié)疾病的嚴(yán)重程度并抑制生發(fā)中心的形成[13]。

3.2LRRC15目前被認(rèn)為是一個(gè)有應(yīng)用前景的抗癌靶點(diǎn)。而在RA方面,LRRC15在RA患者的滑膜組織中存在過(guò)表達(dá),并與滑膜細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和血管生成能力增加以及促炎細(xì)胞因子的加速釋放有關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示,關(guān)節(jié)炎的發(fā)展導(dǎo)致平衡型滑膜成纖維細(xì)胞萎縮,出現(xiàn)以LRRC15表達(dá)為標(biāo)志的滑膜成纖維細(xì)胞輪廓,其功能是增強(qiáng)炎癥反應(yīng)和基質(zhì)分解過(guò)程[14]。敲低LRRC15表達(dá)不僅能夠在體外抑制滑膜細(xì)胞的侵襲性表型,而且在體內(nèi)也能顯著抑制膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠的滑膜增殖,減少骨侵襲和破壞[2]。He等[5]也證實(shí)了LRRC15在RA模型大鼠滑膜組織中表達(dá)顯著增加。本研究結(jié)果也顯示LRRC15是參與RA微環(huán)境動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)的關(guān)鍵因子。

3.3SDC-1也被稱為CD138,它可與許多配體相互作用,引發(fā)與細(xì)胞黏附、血管生成、炎癥和組織修復(fù)相關(guān)的生物事件[15]。血清SDC-1被認(rèn)為是炎癥活動(dòng)的潛在標(biāo)志物[16]。阻斷白介素(interleukin,IL)-34/SDC-1通路可減輕膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎癥和骨破壞,并加劇血管生成[17]。Deyab等[18]研究表明,RA患者血清C反應(yīng)蛋白水平與SDC-1水平呈顯著正相關(guān),當(dāng)RA患者病情得到控制后,血清SDC-1水平顯著降低。在其他風(fēng)濕性疾病中也觀察到相似的現(xiàn)象,如SDC-1水平與系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動(dòng)指數(shù)及抗dsDNA抗體水平呈正相關(guān),活動(dòng)性狼瘡腎炎患者的血清SDC-1水平也高于非活動(dòng)性狼瘡腎炎患者及非腎炎患者[19]。

3.4YBX3是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,參與調(diào)節(jié)上皮形態(tài)發(fā)生和穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)[20]。尤其在腫瘤性疾病方面的研究較為集中。YBX3通過(guò)調(diào)節(jié)膽汁酸生物合成途徑導(dǎo)致肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移[21]。此外,YBX3高表達(dá)與直腸癌的深度浸潤(rùn)相關(guān),抑制YBX3表達(dá)可以減少體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)[22]。另外,抑制YBX3表達(dá)也可以提高結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[23]。然而,盡管YBX3的上調(diào)增加了癌細(xì)胞侵襲和腫瘤化療耐藥,但在某些腫瘤中也顯示出抗癌作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)YBX3在低級(jí)別腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)水平較高,而在高級(jí)別腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)降低[24]。本研究發(fā)現(xiàn)YBX3在RA中扮演重要角色,值得進(jìn)一步通過(guò)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)開(kāi)展研究。

3.5RA是一種全身炎癥性自身免疫性疾病,理想的治療策略應(yīng)該是在組織損傷之前重新誘導(dǎo)自我耐受[25]。因此,明確疾病的免疫機(jī)制可為治療提供重要幫助。本研究通過(guò)xCell算法探討了RA的免疫特征,發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞呈高表達(dá),這可能是RA發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵免疫細(xì)胞。在RA中,B細(xì)胞主要向CD4+T輔助細(xì)胞呈遞自身抗原,外周血中的B細(xì)胞可分泌多種不同的細(xì)胞因子參與骨破壞,包括腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-6和IL-1β等[26]。目前,B細(xì)胞抑制劑利妥昔單抗在治療RA中取得良好效果?；そM織中的特殊成分和體內(nèi)產(chǎn)生的內(nèi)源性物質(zhì)可由樹(shù)突狀細(xì)胞作為自身抗原呈現(xiàn),激活CD4+T細(xì)胞并導(dǎo)致炎癥。Inamo等[27]認(rèn)為可使用CD4+T細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)RA緩解和非緩解情況進(jìn)行分類。T濾泡輔助細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的一種亞型,可以幫助B細(xì)胞調(diào)節(jié)抗體產(chǎn)生,從而進(jìn)一步參與RA的發(fā)生[28]。在RA中,單核細(xì)胞離開(kāi)血液并浸潤(rùn)發(fā)炎的滑膜組織時(shí),可以分化成外周血來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞,通過(guò)促進(jìn)IL-17的產(chǎn)生和向強(qiáng)效破骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化參與骨關(guān)節(jié)破壞;反之,用于控制RA炎癥的生物療法可調(diào)節(jié)單核細(xì)胞向樹(shù)突狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過(guò)程。識(shí)別和控制外周血來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞分化的環(huán)境介質(zhì)以及潛在的分子信號(hào)通路,這可能是RA新療法開(kāi)發(fā)的突破關(guān)鍵[29]。

綜上所述,本研究基于機(jī)器學(xué)習(xí)方法篩選出CXCL13、LRRC15、SDC-1和YBX3等對(duì)RA診斷具有應(yīng)用前景的因子,闡釋了相關(guān)標(biāo)志基因在RA中的生物學(xué)意義及可能的免疫機(jī)制,為RA的診斷和治療靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)提供了參考。但本研究由于數(shù)據(jù)資料的限制,無(wú)法評(píng)估生物標(biāo)志物或免疫細(xì)胞與RA患者臨床特征的關(guān)聯(lián)性,還需要更多的臨床研究數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)一步探索標(biāo)志基因和相關(guān)免疫細(xì)胞在RA中的作用。