徐子悟，朱政清，梁文萱，李 霞，李云耀，周穎倩，劉碧源，孟 蕾*

1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南大學，湖南 長沙 410012；3.湖南省人民醫(yī)院，湖南 長沙 410005；4.湖南交通工程學院，湖南 衡陽 421001

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是最常見的肝癌， 約占所有原發(fā)性肝臟惡性腫瘤的80%，其發(fā)病率和死亡率在全球范圍內均在增加[1]。 盡管目前在HCC 篩查和治療方面取得新進展，但大多數(shù)HCC 患者在診斷時仍處于晚期[2]。 因此，尋找一種新的靈敏且可靠的預后模型，準確預測患者生存率并合理指導治療方案至關重要。

氧化應激是HCC 發(fā)生和發(fā)展的關鍵因素，參與HCC 的遷移、侵襲和轉移[3]。 目前，已有試驗將氧化應激生物標志物用于臨床治療HCC 和預測術后HCC 復發(fā)[4]。 研究表明，許多傳統(tǒng)中藥都含有抗氧化活性的成分，參與調節(jié)氧化應激[5]。 在現(xiàn)代臨床治療中，傳統(tǒng)中藥因其低毒性和良好的臨床療效，已被納入許多疾病的治療方案[6]。

本文擬構建可以精確預測HCC 患者的氧化應激相關基因預后模型，并預測作用模型中樞基因的中藥單體成分，以期為治療HCC的靶向中藥研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集和預處理

從TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov）下載LIHC 隊列的轉錄組測序數(shù)據(jù)、體細胞突變數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)。此外，在GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）補充以GSE14520、GSE62232、GSE74656 HCC 患者轉錄組測序數(shù)據(jù)集。 氧化應激相關基因通過Genecards 數(shù)據(jù)庫檢索“氧化應激”，以相關評分≥7 分作為篩選條件獲得。

1.2 轉錄組差異分析

利用R 語言“DESeq2”包對TCGA-LIHC 原始Counts 數(shù)據(jù)進行差異分析。GEO 數(shù)據(jù)庫的GSE14520、GSE62232、GSE74656 使用“l(fā)imma”包分析差異表達基因。

1.3 氧化應激相關基因預后模型構建

TCGA-LIHC 與GSE62165、GSE62452、GSE28735的共同差異基因（differential genes, DEGs）與獲得的1 399 個氧化應激相關基因取交集，獲得差異表達的氧化應激相關基因。 通過單/多變量Cox 回歸、Lasso 回歸分析預后特征基因。 通過生存分析和ROC 分析，以驗證模型可靠性。

1.4 免疫組織化學圖像分析

從人類蛋白質圖譜（https://www.proteinatlas.org/）獲得人類健康組織和HCC 患者組織的免疫組織化學圖像，用于在蛋白質水平上驗證。

1.5 功能相關中藥預測

通過Coremine Medical 數(shù)據(jù)庫（https://coremine.com/medical/），以P<0.05 作為篩選標準，預測對模型關鍵基因有潛在調控作用的中藥。藥物的性味、歸經通過2020 版《中華人民共和國藥典》進行搜集。 使用TCMSP、HERB、ETCM、TCMID 數(shù)據(jù)庫檢索中藥成分，使用SwissADME（www.swissadme.ch）以MW<500、Hdon<5、Hacc<10、LogP<5 為篩選條件篩選中藥成分。 最終基于Autodock vina[7]軟件對篩選后的中藥成分進行分子對接。

1.6 中藥水提物制備

中藥材于80 ℃水中熬煮6 h，水提3 次。 提取液過濾，去除殘渣后，將提取液放入旋轉蒸發(fā)儀濃縮成浸膏，噴霧干燥獲得藥物干粉，用于后續(xù)實驗。

1.7 細胞培養(yǎng)及處理

用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)Hep3B 細胞，培養(yǎng)基每2～3 d 更換1 次。 當細胞匯合度約為90%時，用0.25%胰蛋白酶溶液進行傳代培養(yǎng)。

1.8 細胞活力評估

Hep3B 細胞以5×103個/孔接種于96 孔板，分別使用不同濃度馬錢子水提物和龍葵水提物（0、0.390 625、0.781 25、1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50、100 mg·mL-1）干預HepG2 細胞48 h 和72 h 后，每孔加入100 μL 10% MTT 溶液，4 h 后用酶標儀測定490 nm 處吸光度（A），計算細胞存活率。 細胞存活率=（A 加藥－A 空白）/A 空白×100%。

1.9 Westorn blot 檢測

使用IP 裂解緩沖液制備來自Hep3B 細胞系的全蛋白裂解物，然后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質印跡。 所用抗體及其稀釋濃度如下：SLC7A11（1∶2 000）、β-Actin（1∶2 500）（上海碧云天生物技術有限公司，批號分別為AA128、AF7992）。

2 結果

2.1 HCC 患者基本信息

本研究數(shù)據(jù)轉錄組來源TCGA 數(shù)據(jù)庫，TCGA臨床數(shù)據(jù)見表1。

表1 TCGA 列隊基線資料表

2.2 篩選差異氧化應激相關基因

對TCGA 數(shù)據(jù)庫和GSE14520、GSE62232、GSE-74656 數(shù)據(jù)集進行差異分析，分別有4 531、1 222、1 442 和972 個基因被鑒定為DEGs（圖1A—D）。4 個數(shù)據(jù)集共有356 個交集DEGs（圖1E），其中47 個基因被識別為氧化應激相關DEGs（圖1F）。

圖1 HCC 氧化應激相關基因鑒定

2.3 預測模型的構建與評價

單變量Cox 回歸鑒定31 個預后相關基因（圖2A），Lasso 回歸篩選進一步篩選出7 個基因（圖2B—C）。 多變量Cox 回歸以SLC7A11（P=0.047）和EZH2（P=0.016）構建預后相關基因模型（圖2D）。 ROC 曲線顯示模型可以靈敏地預測患者的生存狀況 （圖2E）。 高風險組相較低風險組平均生存年數(shù)更低（圖2F），生存率顯著低于低風險組（P<0.001）（圖2G）。

圖2 HCC 氧化應激相關關鍵基因患者預后模型及其預后效能

2.4 關鍵基因的生存分析與表達驗證

TCGA 和GEO 數(shù)據(jù)庫配對樣本數(shù)據(jù)集表明，EZH2 和SLC7A11 的表達在HCC 患者中均有顯著增加（P<0.001）（圖3A—B），并且與與預后相關（P<0.001）（圖3C—D）。為了進一步驗證，本研究團隊使用從Human Protein Atlas 公共數(shù)據(jù)庫獲得到肝癌患者組織和健康肝組織中IHC 圖像，可見肝癌組織中的EZH2 主要定位于細胞核內，且蛋白表達增加（圖3E）。

圖3 關鍵HCC 氧化應激相關基因表達水平

2.5 相關中藥網(wǎng)絡和分子對接

通過Coremine Medical 醫(yī)學數(shù)據(jù)檢索到作用模型基因EZH2 中藥24 味，SLC7A11 潛在中藥9 味（表2）。 灰色底色為Affinity>-7.0，藍色底色為Affinity<-7.0，深藍色底色為中藥成分，紅色底色為關鍵基因的蛋白靶點（圖4A）。 對中藥進行性味、歸經分析，大部分中藥具有性寒、味苦特點，肝經為主要富集的經絡（圖4B—D）。在對中藥成分與相應模型蛋白的對接結果中，丹參、白芷、馬錢子等中藥成分與模型蛋白有較好親和力（圖4E）。其中，龍葵的5'-甲氧基松脂素和馬錢子的馬錢子N-氧化物（brucine Noxide, BNO）Affinity<-10.0，分別作用SLC7A11 的247號丙氨酸和198 號賴氨酸（圖4F）。

圖4 HCC 氧化應激相關中藥成分網(wǎng)絡以及對接結果

表2 關鍵基因的中藥預測

2.6 關鍵藥物抑制Hep3B 細胞的增殖和SLC7A11蛋白表達

以梯度濃度龍葵和馬錢子水提液分別干預Hep3B 細胞，結果顯示藥物對Hep3B 細胞的抑制能力呈時間和劑量依賴性（圖5A）。以48 h 條件下藥物的1/2×IC50藥物濃度干預細胞后檢測SLC7A11 靶點表達情況顯示，龍葵和馬錢子水提液能夠抑制SLC7A11 蛋白的表達（圖5B）。

圖5 龍葵（LK）和馬錢子（MZQ）水提液對Hep3B 細胞增殖和SLC7A11 蛋白表達的影響

3 討論

HCC 是全球第三大致死癌癥類型，需要有效的治療和診斷策略來預防其發(fā)生發(fā)展和轉移氧化應激顯著影響各種功能和過程，如細胞增殖、分化、血管生成和代謝，并與各種疾病的病理生理學有關[4]。肝臟是ROS 攻擊的主要器官，伴隨著過量的ROS，氧化應激和細胞代謝受損參與肝損傷的發(fā)生和發(fā)展[8]。 有研究證明，氧化應激會促進非酒精脂肪肝發(fā)生各類病理性變化，并將進一步促進肝癌發(fā)生[9]。

本文基于氧化應激相關基因成功地篩選出EZH2、SLC7A11，并以此構建了HCC 中的氧化應激相關基因的預后模型，其有效性在Kaplan-Meier 曲線和時間依賴ROC 曲線得以證明，尤其是在第5 年時AUC 為0.650，說明該模型具有良好的預測能力。通過分析模型基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)高表達EZH2或SLC7A11 的HCC 患者，其預后情況較差，這與目前研究一致[10]。中藥已經發(fā)展了數(shù)千年，雖然中藥配方中的化學成分復雜，但中藥的這一特點與腫瘤的全系統(tǒng)、多靶點治療相適應[11]。本研究預測了預后模型中關鍵基因的潛在治療中藥。 BNO 是馬錢子在炮制過程中由毒性成分馬錢子堿轉化而來的一種特殊生物堿[12]，具有引發(fā)線粒體凋亡途徑誘導HCC 凋亡的功能[13]。而目前在癌癥治療方面尚無有關5'-甲氧基松脂素的研究。 本文研究中預測到馬錢子中的BNO 與SLC7A11 的賴氨酸具有很強的親和力。此外，作用模型關鍵基因的中藥主要富集于肝經，性寒味苦也是歸肝經中藥的特點[14]，表明在HCC 中EZH2和SLC7A11 積極的治療潛力。

研究進一步通過MTT 法檢測馬錢子以及龍葵水提物對Hep3B 肝癌細胞系增殖的影響，結果展示出細胞存活率隨著藥物濃度和處理時間的增加而下降，說明兩味中藥具有抑制Hep3B 細胞增殖的能力。此外，通過檢測細胞中SLC7A11 蛋白表達，發(fā)現(xiàn)在馬錢子以及龍葵水提物處理細胞后，Hep3B 細胞的SLC7A11 蛋白表達水平下降，說明兩位中藥能夠下調SLC7A11 水平。

EZH2 是一種組蛋白甲基轉移酶，能三甲基化組蛋白H3 的27 位賴氨酸（H3K27me3）。EZH2 的活化有助于表觀遺傳轉錄沉默，而非突變表觀遺傳重編程已經被認為是癌癥新的重要特征之一[15]。 EZH2可通過T 細胞功能障礙和T 細胞排斥促進腫瘤免疫逃逸[16]。 SLC7A11 是溶質載體（Solute Carrier, SLC），屬于胱氨酸/谷氨酸逆向轉運蛋白，主要負責質膜上氨基酸的轉運[17]。 SLC7A11 在鐵死亡中扮演著關鍵調控者的角色。 鐵死亡作為一種非凋亡性細胞死亡過程，已成為腫瘤治療的新靶向策略[18]。SLC7A11 還是作為控制Treg 細胞增殖潛能的關鍵決定因素[19]。

綜上所述，本研究成功構建了一個基于氧化應激相關基因EZH2 和SLC7A11 的HCC 預后模型，該模型能夠敏感地預測患者的生存狀況。 此外，通過對模型相關基因的分析，本研究豐富了傳統(tǒng)中藥對于模型中關鍵基因治療的理解。 同時，模型中的關鍵基因在腫瘤治療方面也具有重要的研究價值，有望成為潛在的治療靶點。