戴宗順，張 逢，林 也，黃 紅，李 鑫，彭清華*，蔡 雄*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.寧鄉(xiāng)市人民醫(yī)院中醫(yī)風(fēng)濕免疫科，湖南 長(zhǎng)沙 410600

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA）是一種以關(guān)節(jié)滑膜慢性病變，進(jìn)行性關(guān)節(jié)軟骨與骨侵蝕，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形、功能障礙為臨床特征的自身免疫性疾病[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)RA 患病率為0.42%，男女比例約為1∶4[2]，與普通人群相比，RA 的心血管死亡風(fēng)險(xiǎn)增加50%[3]。 目前，RA 的臨床治療策略主要是抑制關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，阻止病變進(jìn)展，從而達(dá)到緩解病情，提高、維持患者生存質(zhì)量的目的[4]。目前，治療RA 的藥物主要包括非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、緩解病情抗風(fēng)濕藥（disease-modifying anti-rheumatic drug, DMARD）、靶向小分子藥物（如托法替布）、生物制劑（如阿達(dá)木單抗）等。 臨床一線DMARD 如甲氨蝶呤、來氟米特等，其有效性在臨床使用中雖得到了廣泛認(rèn)可，但臨床緩解率仍然偏低，且長(zhǎng)期服用存在明顯胃腸道反應(yīng)、 肝腎功能損害等不良反應(yīng)，1/3 以上患者因不能耐受而中斷治療；新型生物制劑費(fèi)用昂貴，且可能導(dǎo)致惡性腫瘤、結(jié)核、嚴(yán)重感染等風(fēng)險(xiǎn)增加[2，5]。 如何在不增加毒副作用的基礎(chǔ)上提高RA 治療收益，是目前亟待解決的問題。

中醫(yī)藥以其多成分、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)整體調(diào)節(jié)緩解RA 病情，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[6-7]。青風(fēng)藤與白芍是治療RA 的常用中藥，臨床常配伍使用，而青藤堿與芍藥苷分別是青風(fēng)藤與白芍的主要有效成分[8-9]。 本課題組及其他研究皆證實(shí)青藤堿或芍藥苷對(duì)RA 動(dòng)物模型以及患者具有一定療效[10-11]，但其單獨(dú)抗RA的藥效作用強(qiáng)度均相對(duì)較弱，臨床主要用于輔助治療。 為進(jìn)一步提高其治療RA 的療效，課題組前期研究明確了青藤堿配伍芍藥苷的最佳配比劑量[12-13]。為此，本研究擬進(jìn)一步明確青藤堿配伍芍藥苷協(xié)同治療RA 的療效及其作用機(jī)制，以期為中醫(yī)藥配伍用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雌性Wistar 大鼠，體質(zhì)量100～120 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK（湘）2013-0005，動(dòng)物可自由飲食和活動(dòng)，溫度20～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，12 h 晝夜交替。 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過，審查號(hào)為20140406。實(shí)驗(yàn)過程中無動(dòng)物死亡，所有操作均遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理福利動(dòng)物倫理。

1.2 主要試劑

青藤堿、芍藥苷（西安小草植物科技公司，批號(hào)：20131115、20141020）；甲氨蝶呤（上海吉至生化科技有限公司，批號(hào)：M1243390A）；牛Ⅱ型膠原（bovineⅡ-type collagen, CⅡ）（美國(guó)Chondrex 公司，批號(hào)：U27038384）；非完全弗氏佐劑（incomplete freund's adjuvant, IFA）（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司，批號(hào)：W09038383）；EDTA 脫鈣液（福州文萊生物科技有限公司，批號(hào)：20222XM0727）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）ELISA 試劑盒（武漢華美公司；批號(hào)：00151508、00261899）；BCA 測(cè)定試劑盒（北京康為世紀(jì)公司，批號(hào)：GR100310-1）；基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1, TIMP-1）抗體（美國(guó)Abcam 公司，批號(hào)：GR172655-1、P0013B、60008-1-Ig）；RIPA 組織蛋白裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：SA00001-1）；β-actin 抗體、羊抗小鼠-IG、超敏ECL 發(fā)光液（美國(guó)Proteintech 公司，批號(hào)：SA00001-2、B500022、085982）。

1.3 主要儀器

足腫測(cè)定儀（意大利UGO 公司，型號(hào)：Basile 37140）；高分辨率小動(dòng)物微型CT（美國(guó)PerkinElmer公司，型號(hào)：Quantum FX Demo）；勻漿機(jī)（德國(guó)IKA公司，型號(hào)：T10 basic）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher 公司，型號(hào)：Varioskan Flash）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司，型號(hào)：Chemi Doc XRS+）；電子天平（日本島津公司，型號(hào)：ATY224）。

1.4 分組、造模、給藥及取材

60 只雌性Wistar 大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、甲氨蝶呤組、青藤堿組、芍藥苷組、青藤堿配伍芍藥苷組（青芍配伍組），每組10 只。 于大鼠尾根部皮內(nèi)注射0.20 mL CⅡ/IFA 乳劑（含200 μg CⅡ），致敏后第7 天再次多點(diǎn)注射0.10 mL CⅡ/IFA 乳劑加強(qiáng)免疫[14]。 在造模后，每天觀察大鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病癥狀，每3 天記錄四肢關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分、測(cè)量雙后足腫脹容積，基于關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分表對(duì)造模大鼠進(jìn)行評(píng)分，并剔除未發(fā)病鼠，記錄每只大鼠4 個(gè)足爪，評(píng)分最高分為16 分。 評(píng)分≥4 分，足腫脹容積>1.6 mL，提示造模成功[15]。 用藥劑量參考課題組前期研究結(jié)果[16]。 自膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen induced arthritis, CIA）造模當(dāng)天起，各組動(dòng)物以1 mL/100 g 進(jìn)行灌胃給藥，正常組和模型組灌胃等體積蒸餾水，青藤堿組予青藤堿50 mg/kg 灌胃，芍藥苷組予芍藥苷120 mg/kg 灌胃，青芍配伍組予青藤堿50 mg/kg+芍藥苷120 mg/kg 灌胃，每天1 次，連續(xù)30 d。 甲氨蝶呤組大鼠在CIA 造模后第1、3、7、14、21、28 天給予甲氨蝶呤1 mg/kg 灌胃。 末次給藥后，次日用2%戊巴比妥納麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，從踝關(guān)節(jié)以上截取大鼠雙后足，一部分用于放射學(xué)與組織病理學(xué)檢查，另外一部分用于蛋白檢測(cè)。

1.5 藥效作用評(píng)價(jià)

造模后，每天觀察大鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病癥狀，每3 天進(jìn)行雙后足腫脹容積測(cè)量、四肢關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分及體質(zhì)量稱量。

1.6 放射學(xué)與組織病理學(xué)檢查

治療結(jié)束后，采用小動(dòng)物CT 掃描大鼠后足，評(píng)價(jià)關(guān)節(jié)骨侵蝕程度；2%戊巴比妥納麻醉后處死大鼠，切除后足，4%多聚甲醛固定，EDTA 脫鈣，石蠟包埋、切片；HE 染色后，于光學(xué)顯微鏡下觀察其病理學(xué)變化。采用組織病理學(xué)滑膜評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)估：關(guān)節(jié)腔間隙正常，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，無滑膜組織增殖，無骨組織破壞為0 分；關(guān)節(jié)腔間隙輕度改變，炎癥細(xì)胞少量浸潤(rùn)，滑膜組織輕度增殖，骨組織輕度破壞為1 分；關(guān)節(jié)腔間隙狹窄，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜組織中度增殖，骨組織中等程度破壞為2 分；關(guān)節(jié)腔間隙明顯狹窄，炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn)，滑膜組織大量增殖、血管翳形成，骨組織嚴(yán)重破壞為3 分[5，15]。

1.7 炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β 檢測(cè)

腹主動(dòng)脈采血，4 ℃、3 500 r/min 離心5 min（離心半徑10 cm）。 取血清，按照ELISA 試劑盒說明書，檢測(cè)各組大鼠血清TNF-α、IL-1β 含量。

1.8 MMP-2、MMP-9 和TIMP-1 檢測(cè)

取雙后足，剔除多余肌肉、筋膜，置于勻漿機(jī)內(nèi)，加入液氮，破碎。 取100 mg 骨組織，加組織裂解液，冰上提取蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。 采用20 μL的上樣體系，校齊各孔的蛋白含量，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，MMP-2、MMP-9 和TIMP-1 抗體按照1∶1 000 稀釋后孵育，4 ℃過夜，洗膜，室溫孵育二抗（1∶2 000），TBST 洗膜后，超敏ECL 發(fā)光液顯色，在核酸蛋白表達(dá)成像系統(tǒng)中進(jìn)行顯影成像。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 計(jì)量資料用“±s”表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，據(jù)方差齊性檢驗(yàn)，方差齊與不齊分別采用LSD法和Games-Howell 法。 P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 青藤堿配伍芍藥苷對(duì)CIA 大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀的影響

在第12、15、18、21、24、27、30 天，與正常組比較，模型組足腫脹容積、關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分增加（P<0.01），體質(zhì)量降低（P<0.01）；與模型組對(duì)比，甲氨蝶呤組、青藤堿組、芍藥苷組和青芍配伍組大鼠足腫脹容積及關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分均降低（P<0.01），體質(zhì)量增加（P<0.01）；與甲氨蝶呤組比較，青藤堿組、芍藥苷組大鼠足腫脹容積、關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分增加（P<0.01），體質(zhì)量降低（P<0.01）；與青藤堿組比較，青芍配伍組大鼠足腫脹容積及關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分均降低（P<0.01），體質(zhì)量增加（P<0.01）；與芍藥苷組比較，青芍配伍組大鼠足腫脹容積及關(guān)節(jié)指數(shù)評(píng)分均降低（P<0.01），體質(zhì)量增加（P<0.01）。 詳見圖1。

圖1 各種大鼠足腫脹容積、關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分、體質(zhì)量比較（n=10）

2.2 青藤堿配伍芍藥苷對(duì)CIA 大鼠關(guān)節(jié)骨侵蝕的影響

正常組大鼠趾跖關(guān)節(jié)對(duì)位關(guān)系良好，關(guān)節(jié)間隙清晰，未見關(guān)節(jié)面狹窄或增寬，關(guān)節(jié)面光滑平整，關(guān)節(jié)周圍軟組織未見腫脹。與正常組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)呈彌漫性腫脹，邊緣骨質(zhì)侵蝕，關(guān)節(jié)間隙狹窄甚至消失，骨質(zhì)疏松，有明顯的骨侵蝕，明顯畸形；甲氨蝶呤組大鼠關(guān)節(jié)可見趾跖關(guān)節(jié)間隙模糊，關(guān)節(jié)腔間隙狹窄程度較輕，骨侵蝕較輕，無明顯關(guān)節(jié)畸形改變；青藤堿組大鼠部分關(guān)節(jié)腫脹，趾跖關(guān)節(jié)間隙明顯變窄，骨侵蝕明顯，可見關(guān)節(jié)畸形；芍藥苷組大鼠關(guān)節(jié)間隙變窄，骨侵蝕明顯，可見關(guān)節(jié)變形；青芍配伍組關(guān)節(jié)間隙狹窄程度及骨侵蝕較輕，關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)較完整。

與正常組比較，其余各組關(guān)節(jié)骨侵蝕評(píng)分明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，甲氨蝶呤組、芍藥苷組、青芍配伍組大鼠關(guān)節(jié)骨侵蝕評(píng)分明顯降低（P<0.05，P<0.01）；與甲氨蝶呤組比較，青藤堿組、芍藥苷組關(guān)節(jié)骨侵蝕評(píng)分明顯升高（P<0.01）；與青藤堿組比較，青芍配伍組大鼠關(guān)節(jié)骨侵蝕評(píng)分明顯降低（P<0.01）；與芍藥苷組比較，青芍配伍組大鼠關(guān)節(jié)骨侵蝕評(píng)分明顯降低（P<0.01）。 詳見圖2、表1。

表1 各組大鼠關(guān)節(jié)骨侵蝕評(píng)分比較（±s，n=10）

表1 各組大鼠關(guān)節(jié)骨侵蝕評(píng)分比較（±s，n=10）

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與甲氨蝶呤組比較，▲▲P<0.01；與青藤堿組比較，●●P<0.01；與芍藥苷組比較，○○P<0.01。

組別正常組模型組甲氨蝶呤組青藤堿組芍藥苷組青芍配伍組骨侵蝕評(píng)分/分0±0 4.1±0.68**1.8±0.35**##3.6±0.75**▲▲3.4±0.63**#▲▲2.2±0.62**##●●○○

圖2 各組大鼠關(guān)節(jié)骨破壞比較

2.3 青藤堿配伍芍藥苷對(duì)CIA 大鼠組織病理改變的影響

正常組關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)完整，軟骨下骨結(jié)構(gòu)清晰。 模型組大鼠踝關(guān)節(jié)組織可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜組織顯著增生，血管翳生成并伴有嚴(yán)重的骨破壞。青藤堿組和芍藥苷組滑膜中等程度增生，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞腫脹。 甲氨蝶呤組和青芍配伍組大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞輕度增生，可見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)于組織中。 詳見圖3。

圖3 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理改變（HE，×100）

與正常組比較，其余各組關(guān)節(jié)組織病理評(píng)分明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，甲氨蝶呤組、青藤堿組、芍藥苷組、青芍配伍組大鼠關(guān)節(jié)組織病理評(píng)分明顯降低（P<0.05，P<0.01）；與甲氨蝶呤組比較，青藤堿組、芍藥苷組關(guān)節(jié)組織病理評(píng)分明顯升高（P<0.01）；與青藤堿組比較，青芍配伍組大鼠關(guān)節(jié)組織病理評(píng)分明顯降低（P<0.05）；與芍藥苷組比較，青芍配伍組大鼠關(guān)節(jié)組織病理評(píng)分降低（P<0.05）。 詳見表2。

表2 各組踝關(guān)節(jié)組織病理評(píng)分比較（±s，n=10）

表2 各組踝關(guān)節(jié)組織病理評(píng)分比較（±s，n=10）

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與甲氨蝶呤組比較，▲▲P<0.01；與青藤堿組比較，●P<0.05；與芍藥苷組比較，○P<0.05。

組別正常組模型組甲氨蝶呤組青藤堿組芍藥苷組青芍配伍組關(guān)節(jié)組織病理評(píng)分/分0 4.80±0.62**2.20±0.36**##3.80±0.89**#▲▲3.50±0.82**##▲▲2.70±0.56**##●○

2.4 青藤堿配伍芍藥苷對(duì)CIA 大鼠血清TNF-α、IL-1β 表達(dá)的影響

與正常組比較，其余各組大鼠血清TNF-α、IL-1β明顯增高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，甲氨蝶呤組、青藤堿組、芍藥苷組、青芍配伍組大鼠血清TNF-α、IL-1β 水平明顯下降（P<0.05，P<0.01）；與甲氨蝶呤組比較，青藤堿組、芍藥苷組TNF-α、IL-1β水平明顯增高（P<0.01）；與青藤堿組比較，青芍配伍組大鼠血清TNF-α、IL-1β 水平下降（P<0.05，P<0.01）；與芍藥苷組比較，青芍配伍組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平下降（P<0.05，P<0.01）。 詳見表3。

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β 表達(dá)水平比較（±s，n=10）

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β 表達(dá)水平比較（±s，n=10）

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與甲氨蝶呤組比較，▲▲P<0.01；與青藤堿組比較，●P<0.05，●●P<0.01；與芍藥苷組比較，○P<0.05，○○P<0.01。

組別正常組模型組甲氨蝶呤組青藤堿組芍藥苷組青芍配伍組TNF-α 10.88±3.69 57.79±9.62**26.41±5.67**##47.90±8.51**##▲▲46.13±7.52**##▲▲30.23±6.48**##●●○○IL-1β 22.43±8.24 95.70±15.61**39.07±12.96*##78.53±15.14**#▲▲72.94±15.76**#▲▲52.78±14.35**##●○

2.5 青藤堿配伍芍藥苷對(duì)CIA 大鼠MMP-2、MMP-9和TIMP-1 表達(dá)的影響

與正常組比較，其余各組大鼠骨組織MMP-2、MMP-9、TIMP-1 表達(dá)明顯增高（P<0.05，P<0.01）。與模型組比較，甲氨蝶呤組、青藤堿組大鼠骨組織MMP-2、MMP-9、TIMP-1 表達(dá)明顯下降（P<0.05，P<0.01）；芍藥苷組大鼠骨組織MMP-2、MMP-9 表達(dá)明顯下降（P<0.01）；青芍配伍組大鼠骨組織MMP-2、MMP-9 表達(dá)明顯下降（P<0.01），TIMP-1 表達(dá)顯著增高（P<0.01）。與甲氨蝶呤組比較，青藤堿組、芍藥苷組骨組織MMP-2、MMP-9 表達(dá)明顯增高（P<0.01）。與青藤堿組比較，青芍配伍組大鼠骨組織MMP-2、MMP-9 表達(dá)明顯降低（P<0.01），TIMP-1 表達(dá)顯著增高（P<0.01）。 與芍藥苷組比較，青芍配伍組大鼠骨組織MMP-2、MMP-9 明顯降低（P<0.01），TIMP-1 表達(dá)顯著增高（P<0.01）。 詳見圖4、表4。

表4 各組大鼠MMP-2、MMP-9 和TIMP-1 表達(dá)水平比較（±s，n=10）

表4 各組大鼠MMP-2、MMP-9 和TIMP-1 表達(dá)水平比較（±s，n=10）

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與甲氨蝶呤組比較，▲▲P<0.01；與青藤堿組比較，●●P<0.01；與芍藥苷組比較，○○P<0.01。

組別正常組模型組甲氨蝶呤組青藤堿組芍藥苷組青芍配伍組MMP-2 0.59±0.16 5.59±0.80**1.59±0.49*##4.31±0.85**##▲▲4.11±0.64**##▲▲1.89±0.65**##●●○○MMP-9 1.02±0.04 6.30±0.77**1.83±0.48*##5.04±0.75**##▲▲4.82±0.59**##▲▲1.84±0.50**##●●○○TIMP-1 0.99±0.11 2.78±0.44**2.02±0.33**##2.17±0.47**#2.59±0.49**4.07±0.44**##●●○○

圖4 各組大鼠MMP-2、MMP-9 和TIMP-1 電泳圖

3 討論

青風(fēng)藤為防己科植物青藤Sinomenium acutum(Thunb.) Rehd.et Wils.的干燥藤莖。青風(fēng)藤味苦、辛，性平，歸肝、脾經(jīng)，具祛風(fēng)濕、行氣血、利關(guān)節(jié)、止痹痛之功。 青藤堿是從青風(fēng)藤中分離提取出來的一種生物堿單體，藥理藥效研究表明，青藤堿具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抑制免疫等多種生物活性，并已制備成正清風(fēng)痛寧緩釋片及正清風(fēng)痛寧注射液等成藥，臨床上用來治療RA 風(fēng)寒濕痹證[17]。青藤堿在RA 治療藥物分類中，歸屬于植物類治療藥物，但因其生物利用度低，具有強(qiáng)烈的組胺釋放作用，部分患者容易出現(xiàn)瘙癢、出汗、潮紅、腫痛加重現(xiàn)象，從而限制了其在RA 中的廣泛應(yīng)用。 白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根，味苦、酸，性涼，歸肝、脾經(jīng)，可養(yǎng)血柔肝、通痹止痛、斂陰止汗。 芍藥苷作為白芍的主要藥效成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)作用，亦已制備成白芍總苷膠囊用于RA 的治療，在RA 治療藥物中分類為植物類藥物[18]。 但青藤堿及芍藥苷抗RA 作用強(qiáng)度均相對(duì)較弱，臨床主要用于輔助治療[19-20]。 故本研究進(jìn)一步明確，青藤堿配伍芍藥苷協(xié)同抗RA 的藥效及其作用機(jī)制。RA 關(guān)節(jié)中異常活化的滑膜是免疫系統(tǒng)中影響骨穩(wěn)態(tài)的重要部位，滑膜炎是關(guān)節(jié)表現(xiàn)的病理基礎(chǔ)，也是導(dǎo)致繼發(fā)性骨質(zhì)破壞的原因。 而其中的具體機(jī)制涉及免疫細(xì)胞、炎癥因子等一系列信號(hào)傳導(dǎo)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞[21]。 TNF-α、IL-1β 被稱為前炎癥細(xì)胞因子，是關(guān)節(jié)炎癥發(fā)生的重要炎癥因子。 TNF-α由單核巨噬細(xì)胞系大量合成，誘導(dǎo)機(jī)體炎癥級(jí)聯(lián)瀑布效應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)胞因子風(fēng)暴，導(dǎo)致局部血管滲透性增加，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，引起非特異性炎癥反應(yīng)，在炎癥自身免疫性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[22]。 TNF-α 抑制劑通過抑制或中和機(jī)體內(nèi)的TNF-α 細(xì)胞因子，減輕炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)免疫功能，已進(jìn)入臨床使用的TNF-α 抑制劑包括英夫利昔單抗、依那西普、阿達(dá)木單抗、戈里木單抗等[23]。 IL-1β 由激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可促使中性粒細(xì)胞在CIA 大鼠關(guān)節(jié)腔中定向聚集，使其過度激活導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷；另外還可以誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞分泌RANKL，通過RANKL-RANK 信號(hào)通路介導(dǎo)破骨細(xì)胞生成造成骨破壞[24]。 美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局于2001 年批準(zhǔn)IL-1 受體拮抗劑阿那白滯素用于RA，此后，又開發(fā)了特異性結(jié)合IL-1β 的人源化單克隆抗體卡納單抗[25]。 TNF-α 與IL-1β 協(xié)同誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞異常增殖并分泌大量促炎因子，是介導(dǎo)RA關(guān)節(jié)滑膜炎癥反應(yīng)及骨破壞的關(guān)鍵炎癥細(xì)胞因子[26]，可導(dǎo)致組織炎癥浸潤(rùn)，關(guān)節(jié)表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛及功能障礙，阻斷TNF-α、IL-1β 是臨床治療RA 有效的靶點(diǎn)。 同時(shí)，大量增殖的炎癥細(xì)胞誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生MMP-3、MMP-2 等降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，造成關(guān)節(jié)軟骨侵蝕與骨破壞[27]。

本研究結(jié)果顯示，CIA 大鼠關(guān)節(jié)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并伴有嚴(yán)重的骨破壞，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果相一致[28]。青藤堿與芍藥苷配伍聯(lián)用能顯著抑制大鼠足腫脹容積、降低關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分，而青藤堿或芍藥苷單用未見明顯藥效作用，青芍配伍用藥協(xié)同保護(hù)關(guān)節(jié)組織病理改變作用顯著優(yōu)于青藤堿或芍藥苷單用。 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與青藤堿或芍藥苷單用比較，青芍配伍能顯著降低TNF-α、IL-1β 含量。 結(jié)果提示，青藤堿與芍藥苷配伍用藥可協(xié)同抑制TNF-α、IL-1β 細(xì)胞因子的表達(dá)，發(fā)揮抗CIA 藥效作用。

MMP-2 與MMP-9 由巨噬細(xì)胞、成纖維滑膜細(xì)胞及各種結(jié)締組織細(xì)胞產(chǎn)生，是降解骨細(xì)胞外基質(zhì)的重要內(nèi)肽酶，主要通過降解Ⅰ型、Ⅳ型、Ⅴ型和Ⅸ型膠原以及黏合素介導(dǎo)關(guān)節(jié)骨與軟骨侵蝕[29]。而TIMP-1 是MMPs 的天然抑制劑[30]。 本研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿與芍藥苷配伍能顯著降低MMP-2、MMP-9表達(dá)，上調(diào)TIMP-1 表達(dá)，且效果優(yōu)于青藤堿或芍藥苷單用。 結(jié)果表明青藤堿與芍藥苷配伍用藥可能通過抑制MMP-2、MMP-9 表達(dá)，上調(diào)TIMP-1 表達(dá)，發(fā)揮協(xié)同抗CIA 藥效作用。

綜上所述，青藤堿配伍芍藥苷發(fā)揮協(xié)同抗CIA藥效作用，其機(jī)制可能與減少血清中關(guān)鍵的促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β 含量，抑制骨組織MMP-2、MMP-9 表達(dá)，促進(jìn)TIMP-1 表達(dá)有關(guān)，通過抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜增生，減少軟骨侵蝕和骨破壞，從而發(fā)揮療效。中藥配伍后通過多通路、多環(huán)節(jié)作用于機(jī)體而抑制炎癥反應(yīng)和骨破壞，發(fā)揮治療作用，其更深一步的機(jī)制尚有待研究闡明。