呂湘琳，齊紅莉，石雪，劉家樂(lè)

（天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384）

氣候變化可以改變環(huán)境因素，如水生生態(tài)系統(tǒng)的鹽度、溫度和溶解氧含量等[1]，特別是鹽度易受氣候變化的影響[2]。鹽度變化可直接或間接影響水生生物的存活、生長(zhǎng)和繁殖[3-5]，導(dǎo)致水生態(tài)系統(tǒng)中特定物種、種群動(dòng)態(tài)和群落組成發(fā)生變化[6]。許多研究表明，鹽度脅迫可導(dǎo)致水生生物生理功能改變[7-10]。了解生物體響應(yīng)和適應(yīng)新鹽度的機(jī)理是探索由鹽度引起的生理、生態(tài)響應(yīng)的研究重點(diǎn)。

原生動(dòng)物纖毛蟲(chóng)是微型生物食物環(huán)中的重要一環(huán)，了解原生動(dòng)物對(duì)鹽度變化的響應(yīng)，對(duì)于預(yù)測(cè)環(huán)境變化對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的影響至關(guān)重要[11]。原生動(dòng)物易于培養(yǎng)，生命周期短，沒(méi)有復(fù)雜的發(fā)育階段，除了在生態(tài)研究中發(fā)揮了重要作用外，利用原生動(dòng)物纖毛蟲(chóng)作為模式生物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)生態(tài)學(xué)研究的優(yōu)勢(shì)也日益得到認(rèn)證[12-14]。

本試驗(yàn)所用的黃色偽角毛蟲(chóng)（Pseudokeronopsis flava）屬于多膜綱，腹毛目，偽角毛蟲(chóng)屬，是一種較為少見(jiàn)的大型海洋纖毛蟲(chóng)[15]。目前對(duì)其研究多集中在分類和細(xì)胞發(fā)生等方向[16]，而生態(tài)學(xué)研究較少。扇形游仆蟲(chóng)（Euplotes vannus）屬于多膜綱，游仆目，游仆蟲(chóng)屬，是一種常見(jiàn)的趨底性纖毛蟲(chóng)，被廣泛應(yīng)用于生態(tài)毒理學(xué)研究[17，18]。黃色偽角毛蟲(chóng)和扇形游仆蟲(chóng)均可作為水質(zhì)檢測(cè)的潛在生物指示物[19]。本試驗(yàn)通過(guò)研究黃色偽角毛蟲(chóng)和扇形游仆蟲(chóng)對(duì)鹽度變化的適應(yīng)性，旨在豐富黃色偽角毛蟲(chóng)和扇形游仆蟲(chóng)的基礎(chǔ)生物學(xué)資料，并為檢測(cè)海水侵蝕和海水淡化提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲(chóng)體的來(lái)源和馴化

試驗(yàn)用扇形游仆蟲(chóng)和黃色偽角毛蟲(chóng)均來(lái)自中國(guó)海洋大學(xué)原生動(dòng)物細(xì)胞庫(kù)，在11 ℃下保種。在（25±1）℃下，用鹽度為30 的滅菌人工海水，以米粒喂食，分別對(duì)蟲(chóng)體進(jìn)行單克隆培養(yǎng)。將在鹽度30下培養(yǎng)的黃色偽角毛蟲(chóng)和扇形游仆蟲(chóng)分別接種于10～70 鹽度的人工海水中培養(yǎng)。針對(duì)過(guò)高和過(guò)低鹽度的黃色偽角毛蟲(chóng)和扇形游仆蟲(chóng)，采用緩慢過(guò)渡方式逐個(gè)鹽度馴化[20]。

1.2 方法

試驗(yàn)人工海水鹽度梯度分別：10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 和70。由蒸餾水與海水晶（中鹽工程技術(shù)研究院有限公司）按照一定比例配制而成。配置好的海水用0.2 μm 的針孔濾膜抽濾，隨后用高溫滅菌鍋滅菌，冷卻后備用。

試驗(yàn)在六孔培養(yǎng)板中進(jìn)行，每個(gè)處理組的海水體積為3 mL，蟲(chóng)體密度為10 ind.·mL-1，設(shè)3 個(gè)平行，每24 h 觀察計(jì)數(shù)一次不同鹽度下兩種纖毛蟲(chóng)種群生態(tài)學(xué)變化。從每組隨機(jī)挑取30 只蟲(chóng)體，測(cè)量其體長(zhǎng)和體寬，以觀察記錄各鹽度下蟲(chóng)體的形態(tài)差異。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2016 做圖，這兩種纖毛蟲(chóng)在不同鹽度下的種群生長(zhǎng)模型使用修正的Logistic 模型（式1）建立，并在Origin 2018 中實(shí)現(xiàn)[21]，以估計(jì)每種鹽度下每個(gè)種群的最大比生長(zhǎng)速率（式2）、停滯期的持續(xù)時(shí)間（式3）。

式中：N0（ind.·mL-1）為初始種群密度，Nt（ind.·mL-1）為時(shí)間t 時(shí)的種群密度，μmax[lg（ind.·d-1）]為最大比生長(zhǎng)速率，λ（d）為停滯期時(shí)間，xc為達(dá)到μmax所需的時(shí)間，k 為xc時(shí)的相對(duì)生長(zhǎng)速率，a 為穩(wěn)定期種群數(shù)量與初始種群數(shù)量的差值[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃色偽角毛蟲(chóng)和扇形游仆蟲(chóng)在不同鹽度下的種群動(dòng)態(tài)

不同鹽度下，黃色偽角毛蟲(chóng)和扇形游仆蟲(chóng)的種群生長(zhǎng)曲線符合邏輯斯蒂增長(zhǎng)曲線，即存在停滯期和指數(shù)生長(zhǎng)期，穩(wěn)定期不明顯（圖1-a，b）。隨著鹽度的升高這兩種纖毛蟲(chóng)的種群峰值均出現(xiàn)在35 鹽度組，黃色偽角毛蟲(chóng)的種群密度最低值出現(xiàn)在70 鹽度組，而扇形游仆蟲(chóng)則出現(xiàn)在65 鹽度組。

圖1 不同鹽度下纖毛蟲(chóng)的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of the ciliates exposed to different salinities

兩種纖毛蟲(chóng)的種群生長(zhǎng)Logistic 曲線擬合結(jié)果如圖2 所示。黃色偽角毛蟲(chóng)的Logistic 曲線在所有鹽度下擬合情況良好；在高鹽度下扇形游仆蟲(chóng)的Logistic 曲線結(jié)果較差，因此鹽度50～70 組使用前5 d 數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。

圖2 不同鹽度下纖毛蟲(chóng)的Logistic 曲線擬合Fig.2 Logistic model fitting of the ciliates exposed to different salinities

兩種纖毛蟲(chóng)的比生長(zhǎng)率和停滯期時(shí)間如圖3所示。在低鹽度下，隨著鹽度升高，黃色偽角毛蟲(chóng)的最大比生長(zhǎng)率逐漸升高，在40 鹽度組中達(dá)到峰值；然而在高鹽度組，黃色偽角毛蟲(chóng)的最大比生長(zhǎng)率隨著鹽度的升高下降，最低值出現(xiàn)在70 鹽度組。隨著鹽度變化，扇形游仆蟲(chóng)的最大比生長(zhǎng)率總體上也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。扇形游仆蟲(chóng)的最大比生長(zhǎng)率的峰值出現(xiàn)在40 鹽度組，最低值在55 鹽度組。

圖3 不同鹽度下纖毛蟲(chóng)的最大比生長(zhǎng)率（μmax）和停滯期（λ）Fig.3 Maximum growth rates（μmax）and lag phases（λ）of the ciliates exposed to different salinities

隨著鹽度升高，黃色偽角毛蟲(chóng)的停滯期逐漸增長(zhǎng)，在低鹽度組停滯期增加較緩慢，高鹽度組，停滯期時(shí)間增加迅速。在10 鹽度組黃色偽角毛蟲(chóng)的停滯期為1.19 d，40 鹽度組停滯期增加到1.57 d，增加了32.17%，而70 鹽度下黃色偽角毛蟲(chóng)的停滯期為3.02 d，相較于10 鹽度組，增加了154.98%。扇形游仆蟲(chóng)的停滯期在低鹽度組隨著鹽度升高逐漸下降，在高鹽度組，則隨鹽度升高而升高（除65 鹽度處理組外）。

2.2 黃色偽角毛蟲(chóng)和扇形游仆蟲(chóng)在不同鹽度下的細(xì)胞形態(tài)變化

鹽度明顯影響黃色偽角毛蟲(chóng)的細(xì)胞大?。▓D4）。在鹽度由55 向60 變化時(shí)，黃色偽角毛蟲(chóng)的長(zhǎng)、短軸長(zhǎng)度明顯下降，分別下降68.17%和69.26%；黃色偽角毛蟲(chóng)的長(zhǎng)寬比在鹽度高于45 時(shí)明顯下降，細(xì)胞形狀發(fā)生變化（圖6），在高鹽度培養(yǎng)下，黃色偽角毛蟲(chóng)蟲(chóng)體縮皺（圖5-i、j），鹽度升高到60 之后，黃色偽角毛蟲(chóng)的游動(dòng)速度減慢甚至停止（圖5-k），在鹽度70 下，蟲(chóng)體變?yōu)閳A形、梭形或其他不規(guī)則形狀（圖5-m）。

圖4 鹽度對(duì)黃色偽角毛蟲(chóng)細(xì)胞形狀的影響Fig.4 Effect of salinity on the cell shape of ciliate P.flava

圖5 鹽度對(duì)黃色偽角毛蟲(chóng)細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.5 Effect of salinity on cell morphology of ciliate P.flava

圖6 鹽度對(duì)扇形游仆蟲(chóng)細(xì)胞形狀的影響Fig.6 Effect of salinity on the cell shape of ciliate E.vannus

鹽度對(duì)扇形游仆蟲(chóng)的細(xì)胞大小影響如圖6。鹽度由55 向60 變化時(shí)，扇形游仆蟲(chóng)的長(zhǎng)、短軸長(zhǎng)度分別下降了69.88%和72.01%，但長(zhǎng)寬比隨著鹽度變化不明顯。鹽度對(duì)扇形游仆蟲(chóng)的細(xì)胞形態(tài)影響如圖8。在鹽度為70 的培養(yǎng)條件下，蟲(chóng)體變?yōu)閳A型（圖7-m）；鹽度升高至65 后，扇形游仆蟲(chóng)的游動(dòng)速度減慢甚至停止游動(dòng)；食物泡逐漸擴(kuò)大直至充滿整個(gè)蟲(chóng)體，使蟲(chóng)體的顏色也發(fā)生改變（圖7-l、7-m）。

圖7 鹽度對(duì)扇形游仆蟲(chóng)細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.7 Effect of salinity on cell morphology of ciliate E.vannus

3 討論

3.1 纖毛蟲(chóng)對(duì)鹽度的耐受及適應(yīng)性機(jī)制

鹽度是影響浮游生物生存的重要理化因子之一，在自然條件下，生物體內(nèi)滲透壓必須保持穩(wěn)定。然而，隨著鹽度變化，生物體需要調(diào)節(jié)自身以維持滲透壓平衡。Kaneshiro 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，降低外部滲透壓導(dǎo)致纖毛蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)游離氨基酸減少，提高外部滲透壓導(dǎo)致纖毛蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)游離氨基酸增加；Weinisch 等[24]發(fā)現(xiàn)，甘氨酸甜菜堿（GB）和四氫嘧啶（Ect）是纖毛蟲(chóng)滲透壓調(diào)節(jié)的主要相容性溶質(zhì)，與外界滲透壓變化呈正相關(guān)。然而，生物體對(duì)滲透壓的調(diào)節(jié)有一定限度，超過(guò)生物體的調(diào)節(jié)限度，會(huì)逐漸失水死亡[4]。在高鹽度或低鹽度環(huán)境下纖毛蟲(chóng)的豐度明顯降低[25,26]。本試驗(yàn)中，黃色偽角毛蟲(chóng)和扇形游仆蟲(chóng)在10～70 鹽度下均可生存，鹽度適應(yīng)性較廣。

3.2 鹽度對(duì)纖毛蟲(chóng)種群生長(zhǎng)的影響

本研究中，不同鹽度下黃色偽角毛蟲(chóng)和扇形游仆蟲(chóng)的種群生長(zhǎng)曲線符合邏輯斯蒂增長(zhǎng)模型。在低鹽度下（10～40）黃色偽角毛蟲(chóng)的最大種群密度以及最大比生長(zhǎng)率均隨著鹽度的升高而增高，而高鹽度（45～70）下黃色偽角毛蟲(chóng)的最大種群密度以及最大比生長(zhǎng)率均隨著鹽度的升高而下降，最適生長(zhǎng)出現(xiàn)在鹽度35～40。扇形游仆蟲(chóng)的最大種群密度隨著鹽度變化呈先上升后下降的趨勢(shì)，最大比生長(zhǎng)率在高鹽度下無(wú)明顯變化，最適生長(zhǎng)鹽度為30～40，升高鹽度均抑制黃色偽角毛蟲(chóng)和扇形游仆蟲(chóng)的種群生長(zhǎng)。Joshi[27]研究發(fā)現(xiàn)，鹽度在5～35 之間，隨著鹽度變化褶皺臂尾輪蟲(chóng)（Brachionus plicatilis）的最大種群密度也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；卞伯仲等[28]將鹽蠶豆蟲(chóng)（Fabrea salina）接種到35～120 鹽度的海水中，發(fā)現(xiàn)鹽蠶豆蟲(chóng)的最大種群密度總體上先升后降，在鹽度100 達(dá)到峰值。這與本研究的結(jié)果基本一致，推測(cè)是由于鹽度變化導(dǎo)致滲透壓改變，而高滲產(chǎn)生滲透壓梯度，降低了細(xì)胞的相對(duì)含水量，留下高度濃縮的細(xì)胞質(zhì)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中核酸、蛋白質(zhì)和其他大分子變性并失去其功能，破壞細(xì)胞膜系統(tǒng)的通透性[24]，影響扇形游仆蟲(chóng)和黃色偽角毛蟲(chóng)正常的代謝活動(dòng)。而張立坤等[29]研究發(fā)現(xiàn)，貪食邁阿密蟲(chóng)（Miamiensis avidus）在鹽度5～40 范圍內(nèi)，種群增長(zhǎng)率沒(méi)有明顯變化，鹽度高于40 時(shí)，貪食邁阿密蟲(chóng)的種群增長(zhǎng)率下降，鹽度60 時(shí)負(fù)增長(zhǎng)。這與本研究結(jié)果不同，推測(cè)是不同纖毛蟲(chóng)對(duì)鹽度的耐受性不同。

纖毛蟲(chóng)在進(jìn)行二分裂前通常存在一個(gè)較短的停滯時(shí)期，這是纖毛蟲(chóng)種群對(duì)外界環(huán)境變化的一種生態(tài)策略[30]。不同的初始密度、食物、鹽度、溫度等條件下，纖毛蟲(chóng)的種群生長(zhǎng)狀態(tài)變化很大。Melo 等[31]發(fā)現(xiàn)，溫度的增高會(huì)延長(zhǎng)嗜熱四膜蟲(chóng)（Tetrahymenathermophila）停滯期。本研究中，鹽度40～70 組的黃色偽角毛蟲(chóng)的停滯期明顯上升，推測(cè)是高鹽度對(duì)黃色偽角毛蟲(chóng)的種群生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制作用，推遲了黃色偽角毛蟲(chóng)進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間；扇形游仆蟲(chóng)則隨著鹽度變化，停滯期呈先下降而后上升的趨勢(shì)（除65 鹽度組外），推測(cè)是低鹽度和高鹽度抑制了扇形游仆蟲(chóng)的生長(zhǎng)。扇形游仆蟲(chóng)相較黃色偽角毛蟲(chóng)對(duì)環(huán)境變化更敏感，適合作為預(yù)測(cè)環(huán)境變化的指示生物。本研究結(jié)果進(jìn)一步證明了滯后期在生物種群動(dòng)力學(xué)中及在環(huán)境變化響應(yīng)中的重要性。

3.3 鹽度對(duì)纖毛蟲(chóng)細(xì)胞形態(tài)的影響

黃色偽角毛蟲(chóng)在正常的生活條件下活體大小約150～240×40～60 μm，蟲(chóng)體柔軟，基本呈細(xì)長(zhǎng)帶狀，前后端略細(xì)縮，長(zhǎng)寬比約為4∶1。扇形游仆蟲(chóng)在正常的生活條件下的蟲(chóng)體長(zhǎng)約90～40 μm，通常為具有棱角的長(zhǎng)方形（而非卵圓形），在營(yíng)養(yǎng)充足時(shí)蟲(chóng)體常變形為闊橢圓形。本研究中，黃色偽角毛蟲(chóng)在高鹽度培養(yǎng)下，蟲(chóng)體明顯縮小變形，體長(zhǎng)縮短，長(zhǎng)寬比下降；扇形游仆蟲(chóng)在高鹽度下蟲(chóng)體縮小，蟲(chóng)體長(zhǎng)短軸均下降。李佳佳[32]研究發(fā)現(xiàn)，暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）鰓絲上氯細(xì)胞在鹽水處理組中發(fā)生細(xì)胞皺縮的現(xiàn)象。宮鈺瑩[33]分析了鹽度對(duì)于杜氏藻（Dunaliella salina）細(xì)胞形態(tài)的影響發(fā)現(xiàn)，低鹽滲透脅迫下細(xì)胞迅速增大，而高鹽滲透脅迫下細(xì)胞會(huì)迅速變小。王梅等[34]研究了擬伍氏游仆蟲(chóng)（Euplotes parawoodruffi）對(duì)滲透壓的適應(yīng)與調(diào)節(jié)，發(fā)現(xiàn)在鹽度5 和45 的培養(yǎng)條件下，擬伍氏游仆蟲(chóng)會(huì)出現(xiàn)短暫的休克現(xiàn)象和蟲(chóng)體的變形、膨脹。這些研究結(jié)果說(shuō)明，在鹽度的變化時(shí)生物會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)自身細(xì)胞的形狀來(lái)適應(yīng)滲透壓的變化，然而不同物種的變化不同。

3.4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，鹽度變化會(huì)抑制黃色偽角毛蟲(chóng)和扇形游仆蟲(chóng)的種群生長(zhǎng)，延長(zhǎng)停滯期時(shí)間，細(xì)胞皺縮。鹽度40 可作為黃色偽角毛蟲(chóng)和扇形游仆蟲(chóng)的最適宜鹽度，此鹽度的人工海水不僅可以用作蟲(chóng)體的保種，還可用作種群的擴(kuò)大培養(yǎng)以實(shí)現(xiàn)在較短的時(shí)間內(nèi)快速擴(kuò)大種群數(shù)量。黃色偽角毛蟲(chóng)和扇形游仆蟲(chóng)對(duì)鹽度變化敏感，可作為指示生物來(lái)預(yù)測(cè)鹽度環(huán)境變化。