張鶴千，潘超，曾曉曼，曹凱欣，李玨賢，王思語，朱嘉樺

（北京師范大學未來教育學院，廣東 珠海 519087）

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）屬于弧菌科、氣單胞菌屬，廣泛分布于土壤、污水和河底，是兼性厭氧無芽孢的革蘭氏陰性短桿菌[1]。該菌可產(chǎn)生多種毒力因子[2]，為魚類流行性敗血癥的主要病原菌，感染后常引發(fā)暴發(fā)性出血病，導致魚類大面積死亡，在患病魚的腸道、鰓、肝等器官均可分離并檢測到嗜水氣單胞菌[3,4]。嗜水氣單胞菌感染宿主種類廣，包括魚類、甲殼類、兩棲類等多種動物類群，在中國常見感染宿主為鯉科魚類[5-8]。嗜水氣單胞菌主要通過侵入腸道引發(fā)宿主全身感染，其致病性易受外界環(huán)境影響且常與其他致病菌協(xié)同作用混合感染[9]。嗜水氣單胞菌感染導致多種魚類流行病頻發(fā)，造成嚴重的經(jīng)濟損失，制約了水產(chǎn)魚類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[10]。

腸道、脾臟、肝臟、腎臟和鰓是魚類重要的免疫相關(guān)器官，在魚類抵御病原菌入侵中發(fā)揮重要作用[11]。嗜水氣單胞菌感染可能引起魚體免疫相關(guān)器官組織炎性水腫及部分壞死，細胞空泡化變性[12]。借助多組學測序技術(shù)可獲得魚體在應(yīng)激擾動和病理狀態(tài)下的相應(yīng)變化，通過基因差異表達分析及相關(guān)信號通路注釋有助于研究嗜水氣單胞菌感染后機體轉(zhuǎn)錄調(diào)控變化，進一步揭示魚體感染病原菌后免疫應(yīng)答機制。嗜水氣單胞菌作為條件致病菌與魚類腸道菌群之間存在微妙的平衡關(guān)系，當平衡被破壞時致病菌將在宿主內(nèi)大量增殖并引發(fā)疾病[13]。魚類的腸道菌群與宿主代謝及免疫密相關(guān)，嗜水氣單胞菌感染可能導致宿主腸道菌群組成及結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，改變腸道菌群穩(wěn)態(tài)對宿主的免疫力及炎癥反應(yīng)有一定影響[14,15]。本文著重闡述嗜水氣單胞菌感染后魚類免疫相關(guān)器官病理學變化，綜述了感染后魚體轉(zhuǎn)錄組學水平變化研究進展，為進一步研究病原菌感染魚類免疫應(yīng)答機制及腸道菌群功能提供參考依據(jù)。

1 組織病理學變化

1.1 腸道組織病理變化

魚類腸道為化學屏障、生物屏障、物理屏障及免疫屏障發(fā)揮抵御病原菌的作用，魚類腸道淋巴結(jié)中有巨噬細胞、淋巴細胞等多種免疫細胞，可分泌出溶菌酶等黏附因子[16,17]。莫桑比克羅非魚（Oreochromis mossambicus）感染嗜水氣單胞菌后易引起“腹水病”，出現(xiàn)腸黏膜壞死、部分粘膜下層出血增厚、粘膜基層呈現(xiàn)水腫以及部分腸微絨毛脫落等現(xiàn)象[18]。組織病理學觀察發(fā)現(xiàn)，自然感染病死的西伯利亞鱘（Acipenser baerii）腸腺上皮細胞壞死脫落，固有膜水腫[19]。斑鱧（Channa maculata）感染嗜水氣單胞菌后，腸黏膜上皮層廣泛性壞死脫落，毛細血管擴張、充血，基底膜排列紊亂[20]。鯽（Carassius auratus）感染嗜水氣單胞菌后腸黏膜上皮細胞和絨毛柱狀細胞脫落，肌肉層結(jié)構(gòu)由緊湊變?yōu)樗缮21]。異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）感染后腸腔褶皺部分黏膜下層出現(xiàn)白細胞浸潤和組織壞死，壞死組織脫落于魚腸腔中[22,23]。草魚（Ctenopharyngodon idella）在嗜水氣單胞菌感染早期腸道出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤、腸黏膜炎癥、絨毛脫落等現(xiàn)象，一周后其腸黏膜開始修復，三周后基本完成[12]（圖1）。雜交鱘和鰻鱺（Anguilla japonica）在感染后組織病理變化相似，均出現(xiàn)小腸絨毛潰爛脫落、腸黏膜上皮細胞明顯增生、部分細胞壞死脫落等現(xiàn)象；但鰻鱺小腸黏膜的固有層和黏膜下層炎性細胞浸潤更嚴重[24-26]。

圖1 肛灌嗜水氣單胞菌后草魚腸道不同時段組織損傷的情況[12]Fig.1 Tissue damage of intestine in grass carp Ctenopharyngodon idella exposed to anal infusion of Aeromonas hydrophila in different periods

1.2 脾臟組織病理變化

脾臟是魚類重要的次級淋巴器官，是中性粒細胞產(chǎn)生、貯存、成熟及抗體形成與B 細胞分化的場所，具有造血及免疫相關(guān)功能[27,28]。鯽感染嗜水氣單胞菌的病理組織切片顯示，脾臟實質(zhì)內(nèi)淋巴細胞和其他細胞排列不規(guī)則、部分細胞溶解、脾臟組織嚴重壞死[21]。感染后西伯利亞鱘脾臟實質(zhì)區(qū)域淋巴細胞數(shù)量減少，紅細胞和中性粒細胞顯著增加[19]。鱖（Siniperca chuatsi）感染嗜水氣單胞菌后脾臟嚴重腫脹和充血，脾細胞排列松散，細胞質(zhì)呈亮紅色，出血明顯[29,30]。青魚（Mylopharyngodon piceus）感染后脾臟組織出現(xiàn)明顯出血、嚴重壞死，脾臟細胞排列松散無序[31]。在感染后期，黃鱔（Monopterus albus）脾臟嚴重充血、出血，部分脾臟組織細胞變性、壞死；美洲鰻鱺（Anguilla rostrata）脾白髓幾乎消失、組織結(jié)構(gòu)疏松，局部出現(xiàn)壞死灶、被膜結(jié)締組織增厚、出血[32,33]。感染發(fā)病的羅非魚脾臟中央動脈和毛細血管充血，巨噬細胞數(shù)量明顯增多，皮質(zhì)部部分細胞壞死[18]。Hossam[34]等觀察感染嗜水氣單胞菌5 h、24 h、48 h 后病理組織切片發(fā)現(xiàn)，5～48 h 斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）從輕度脾炎發(fā)展成重度脾炎；在48 h 時出現(xiàn)纖維性脾炎，紅髓內(nèi)的紅細胞幾乎耗盡，并被纖維素物質(zhì)所取代，病變區(qū)域被巨噬細胞和淋巴細胞浸潤（圖2）。

圖2 嗜水氣單胞菌感染斑點叉尾脾臟組織病理切片[34]Fig.2 Histopathological changes in spleen of channel catfish Ictalurus Punctatus infected with Aeromonas hydrophila

1.3 肝臟組織病理變化

肝臟為魚類免疫相關(guān)器官參與機體先天性免疫，肝巨噬細胞可吞噬越過腸屏障進入肝臟的病原菌[11,35]。感染嗜水氣單胞菌發(fā)病死亡的羅非魚肝臟腫大、肝血竇內(nèi)出血，肝小葉靜脈淤血，肝細胞壞死,部分細胞核消失[18]。感染嗜水氣單胞菌后，尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）肝臟肝細胞出現(xiàn)空泡變性且伴有細胞核固縮和含鐵血黃素積累（圖3）[36]。自然感染患病后低眼無齒巨鯰（Pangasianodon hypophthalmus）肝組織有多處出血、肝細胞壞死嚴重、肝細胞核固縮且伴有肝巨噬細胞細胞聚集（圖4）[37]。黃鱔（Monopterus albus）感染6～9 h 后肝細胞核濃縮偏向一側(cè)，15 h 后肝細胞空泡變性，感染約1 d 后肝臟廣泛出血[38]。黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）感染患病后肝細胞排列紊亂，肝組織大部分壞死，血管、肝膽管和肝細胞不易區(qū)分[39]。鱖感染后肝臟細胞排列紊亂、松散，肝細胞空泡化，部分細胞嚴重腫大甚壞死，細胞核染色加深[40]。金線魚（Nemipterus virgatus）感染后肝臟細胞形態(tài)不規(guī)則，并伴有血細胞浸潤等損傷[41]。劍尾魚（Xiphophorus swordtails）感染嗜水氣單胞菌6 h 后肝臟出現(xiàn)明顯病理組織變化，11～12 h 后肝細胞廣泛的空泡變性、細胞核溶解；18～20 h 可見棕黃色的血源性色素沉積，較短時間內(nèi)感染能引起劍尾魚器官快速病變，導致劍尾魚多器官功能衰竭[42]。

圖3 感染嗜水氣單胞菌的尼羅羅非魚肝臟組織切片[36]Fig.3 Histopathological changes in liver of Nile tilapia（Oreochromis niloticus）infected with Aeromonas hydrophila

1.4 腎臟組織病理變化

魚類的頭腎中存在大量的淋巴細胞，是吞噬病原體、抗原加工、產(chǎn)生免疫球蛋白M（IgM）和黑色素巨噬細胞中心形成免疫記憶的重要場所，后腎在造血和免疫中發(fā)揮重要作用[43]。嗜水氣單胞菌感染引起尼羅羅非魚的腎小管嚴重變性，伴有間質(zhì)單核細胞浸潤和含鐵血黃素積累（圖5）[36]。黃鱔在感染后腎臟的組織病理變化經(jīng)歷了由腎間質(zhì)出血、腎小球出血到腎小管上皮壞死、腎小球出現(xiàn)壞死灶的歷程[38]。草魚感染后頭腎和中腎均出現(xiàn)嚴重壞死、渾濁腫脹、細胞肥大和顆粒細胞漿現(xiàn)象[44]。白斑狗魚（Esox lucius）和團頭魴（Megalobrama amblycephala）感染后組織病理變化較相似：腎小管上皮腫脹、細胞顆粒變性，上皮細胞脫離基底膜、細胞核溶解消失[45-47]。養(yǎng)殖羅非魚感染發(fā)病后魚體亦出現(xiàn)腎小管上皮急性腫脹等病理變化[18]。南亞野鯪（Labeo rohita）在感染后頭腎組織出現(xiàn)廣泛退化和壞死，腎小管內(nèi)膜增厚、管腔扭曲狹窄[48]。

圖5 嗜水氣單胞菌感染尼羅羅非魚腎臟組織切片[36]Fig.5 Histopathological changes in kidney of Nile tilapia(Oreochromis niloticus) infected with Aeromonas hydrophila

1.5 鰓組織病理變化

鰓在呼吸、滲透平衡及免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用，魚鰓通過形成物理屏障和免疫屏障，防止外來病原體入侵[49,50]。嗜水氣單胞菌感染引起鯉（Cyprinus carpio）敗血癥。病魚鰓小片間隙出現(xiàn)少量纖維素滲出，毛細血管充血，部分呈現(xiàn)鰓小片結(jié)構(gòu)崩解及中性白細胞浸潤[51]。西伯利亞鱘感染患病后，鰓小片擴張出血，部分斷裂，鰓基部炎性細胞浸潤[19]。感染嗜水氣單胞菌后，鯰（Silurus asotus）鰓上皮高度壞死脫落、與支持細胞分離，次級鰓片缺失并伴有肥大和增生。斑鱧（Channa maculata）和鰱（Hypophthalmichthys molitrix）感染后鰓呈現(xiàn)相似的組織病理變化，而鰱感染后鰓弓白細胞浸潤更為嚴重[20,22,37,52,53]。鱖和鯽感染嗜水氣單胞菌后鰓絲嚴重出血且上皮細胞增生，部分細胞空泡化變性、壞死，并伴有炎性細胞浸潤（圖6）[22,30,40]。Fernandes 等[54]研究發(fā)現(xiàn)，羅非魚鰓組織的感染通過微循環(huán)系統(tǒng)進行，被吞噬細胞內(nèi)化的嗜水氣單胞菌通過中心靜脈竇的內(nèi)皮進入鰓小瓣間質(zhì)；鰓小瓣上皮細胞嚴重壞死，中心靜脈周圍大量白細胞浸潤。

綜上所述，對自然患病及人工感染魚類免疫相關(guān)器官的組織學觀察發(fā)現(xiàn)，感染嗜水氣單胞菌后魚類腸道、脾臟、肝臟、腎臟和鰓均表現(xiàn)出明顯的病理學變化（表1）。魚類感染后免疫相關(guān)器官組織常呈現(xiàn)出血、壞死、水腫和炎性細胞浸潤等特征，部分組織細胞變形及間隙增大，核溶解，細胞呈現(xiàn)空泡化。

2 轉(zhuǎn)錄組學和微生物組學分析

2.1 感染后魚類轉(zhuǎn)錄組學研究

轉(zhuǎn)錄組學借助高通量測序技術(shù)獲得大量的轉(zhuǎn)錄本，通過分析差異表達基因和基因的結(jié)構(gòu)功能，深入理解病原菌感染后魚類疾病的發(fā)生及免疫答機制。脾臟轉(zhuǎn)錄組測序分析顯示，鯉感染嗜水氣單胞菌后，顯著差異表達基因主要參與連接與粘附、病原體識別、細胞表面受體信號傳導等免疫相關(guān)途徑[71]。大口黑鱸（Micropterus salmoides）脾臟轉(zhuǎn)錄組測序顯示，感染組與注射滅活菌的免疫組差異顯著，感染組中與代謝途徑相關(guān)的差異表達上調(diào)基因數(shù)量和基因表達水平顯著大于免疫組。感染后大口黑鱸死亡率高達85%，可能與魚體代謝紊亂、炎癥反應(yīng)水平升高以及適應(yīng)性免疫反應(yīng)降低等因素密切相關(guān)[1]。Zhang 等[31]分析感染后青魚脾臟組織轉(zhuǎn)錄組學變化，部分差異表達基因被顯著富集到細胞免疫、細胞黏附、病原體識別、補體系統(tǒng)等通路上；感染后補體和凝血級聯(lián)通路極活躍，提示其在青魚抵御病原菌感染中發(fā)揮重要作用。高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)結(jié)合qRT-PCR 方法探究鯽感染嗜水氣單胞菌后皮膚和鰓組織轉(zhuǎn)錄水平上變化，共篩選并驗證11個皮膚免疫相關(guān)差異表達基因和12 個鰓免疫相關(guān)差異表達基因，通過KEGG 信號通路和GO 功能分析發(fā)現(xiàn)，TGF-β、補體及凝血系統(tǒng)、細胞凋亡和吞噬小體等參與鯽皮膚和鰓免疫應(yīng)答分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[72]。對感染嗜水氣單胞菌后歐洲鰻（Anguilla anguilla）肝臟、脾臟、腸道的轉(zhuǎn)錄組測序分析表明，差異表達基因最多的是脾臟，其次為肝臟和腸道[73]。差異表達基因數(shù)和KEGG 途徑分析表明，上述組織中發(fā)生的免疫反應(yīng)存在一致的時間進程，肝臟和脾臟富集到類似的模式識別受體相關(guān)途徑如NOD 樣受體、Toll 樣受體和RIG-I 樣受體信號通路[73]。轉(zhuǎn)錄組測序分析揭示，嗜水氣單胞菌誘導草魚腸道炎癥機制，差異表達基因主要被富集到抗原加工和遞呈、細胞因子—細胞因子受體相互作用等免疫相關(guān)通路上。這些通路與草魚腸道炎癥發(fā)生、進程、調(diào)節(jié)等直接相關(guān)[74]。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果提示，感染后魚體免疫和炎癥相關(guān)通路被激活，機體積極抵御并消滅侵入病原菌。轉(zhuǎn)錄組學分析有助于進一步研究嗜水氣單胞菌感染后魚類免疫應(yīng)答防御機制。

2.2 感染后魚類腸道微生物組學研究

魚類腸道菌群可輔助調(diào)節(jié)宿主眾多生理功能，常被視為宿主的另一個“器官”。腸道菌群在影響宿主生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝、免疫抵御的同時還可能作為潛在致病源，協(xié)同其他病原菌共同加速宿主的感染和死亡[75]。嗜水氣單胞菌感染常引發(fā)宿主腸炎，這種感染依賴于細菌毒素及代謝產(chǎn)物等與宿主腸道內(nèi)常駐微生物競爭，黏附定植于腸腔或腸隱窩[9]。近年來，研究結(jié)果闡釋，嗜水氣單胞菌感染往往伴隨著其他病原菌混合感染，其致病性可能與宿主腸道菌群組成和結(jié)構(gòu)的改變相關(guān)[9,76]。

嗜水氣單胞菌感染后，魚腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)往往發(fā)生劇烈改變，其多樣性和均勻性明顯降低。感染后大口黑鱸腸道微生物組成豐度顯著下降，氣單胞菌屬成為感染組腸道微生物的主要菌群，而注射滅活菌株的大口黑鱸腸道微生物組成無顯著變化[1]。嗜水氣單胞菌感染破壞大口黑鱸腸道微生物穩(wěn)態(tài)，可能是攻毒后魚死亡的主要原因[1]。尼羅羅非魚感染后腸道菌群微生物總數(shù)、多樣性和均勻性都顯著降低，與宿主腸道炎癥進程密切相關(guān)[77]。插管法感染后，鯉腸道菌群中嗜水氣單胞菌數(shù)量迅速上升到較高比例，之后開始持續(xù)下降，7 d 后恢復低比例狀態(tài)，而飼食益生元β-葡聚糖可以緩沖宿主腸道菌群的劇變[78]。草魚感染后腸道菌群組成發(fā)生動態(tài)變化，12 h 出現(xiàn)劇烈波動，24～72 h 趨于緩和，6～9 d 群落多樣性急劇增加，15 d 時有所減少。不同時間腸道菌群的波動主要發(fā)生在變形菌門、厚壁菌門、梭桿菌門和擬桿菌門，屬水平上寡養(yǎng)單胞菌占比呈現(xiàn)較大變化，氣單胞菌和乳酸桿菌等占比減少[15]。嗜水氣單胞菌感染后，宿主腸道菌群的變化可能經(jīng)歷了開端、發(fā)展、高潮、回歸和恢復的循環(huán)，該波動結(jié)果與組織病理學結(jié)果相似[15]。

優(yōu)勢微生物種群往往相互聯(lián)系和影響，共同發(fā)揮維持環(huán)境群落結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)態(tài)的作用，而一些腸道微生物如芽孢桿菌屬可通過產(chǎn)生特定酶、過氧化氫或細菌素等抑制嗜水氣單胞菌在腸道內(nèi)定植和生長[76,79]。鯉腸道內(nèi)優(yōu)勢菌群為變形菌門和擬桿菌門，芽孢桿菌和糞球桿菌對氣單胞菌有較強的拮抗作用[76]。尼羅羅非魚腸道內(nèi)優(yōu)勢菌群為厚壁菌門和梭桿菌門，其中芽孢桿菌抑制嗜水氣單胞菌效果顯著，飼料中添加芽孢桿菌可降低感染死亡率[79]。鯽腸道中乳球菌和芽孢桿菌的豐度與宿主對嗜水氣單胞菌的易感性呈負相關(guān)，當腸道芽孢桿菌屬和乳球菌屬的水平下降時魚病死亡率升高[80]。

3 總結(jié)

組織病理學研究表明，魚類感染嗜水氣單胞菌后免疫相關(guān)器官往往出現(xiàn)出血、壞死和炎性水腫等病理特征，部分組織結(jié)構(gòu)紊亂、細胞核溶解、細胞空泡化嚴重。感染嗜水氣單胞菌后魚體有大量差異表達基因被注釋到免疫相關(guān)信號通路，宿主腸道菌群豐富度和多樣性顯著降低，菌群的組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生動態(tài)變化。蛋白質(zhì)組和代謝組在人類疾病研究中廣泛運用，而在魚類感染和免疫方面報道較少，缺乏魚類感染后多組學聯(lián)合分析相關(guān)研究。微生物組學分析可探索共生菌群與宿主的互作關(guān)系，目前仍較缺乏腸道菌群與魚體免疫抵御功能的具體關(guān)聯(lián)機制研究。未來綜合分析多組學數(shù)據(jù)與組織病理學結(jié)果，從分子水平、細胞水平及組織器官水平研究感染后魚體的變化，有望更深入理解嗜水氣單胞菌感染對魚類的影響。