王秀梅，馬新輝，李照華

三門峽市質量技術監(jiān)督檢驗測試中心（三門峽 472000）

香菇營養(yǎng)價值豐富，富含多糖[1]、蛋白質[2]、礦物質[3]、核酸等多種營養(yǎng)成分，具有抗氧化、改善腸道[4]、降低血脂[5]等多種生理功能，具有很好的營養(yǎng)價值。三門峽地處豫西，是重要的香菇種植基地，已育有豫香1號香菇，產量和品質極高[6]。我國的香菇產品的類型少，常見的有香菇脆片[7]、香菇醬[8]、香菇飲料[9]、香菇面條[10]等。這些產品工藝簡單、附加值低[11]，沒有充分發(fā)揮香菇的營養(yǎng)價值和經濟價值[12]。因此，開發(fā)一種高營養(yǎng)、高附加值的香菇產品尤為重要。

嗜酸乳桿菌是一類微耗氧的革蘭陽性無芽孢細菌，其代謝產物能抑制大腸桿菌的異常發(fā)酵，從而預防便秘、腹瀉。聶遠洋等[13]發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵香菇可以不同程度增加小鼠腸道內益生菌群，從而改善腸道健康。劉麗娜等[14]研究結果表明，乳酸菌發(fā)酵香菇柄可以增加膳食纖維、蛋白質和總酸含量，提高香菇的營養(yǎng)價值和保健功能，為開發(fā)乳酸菌發(fā)酵香菇柄的香菇制品提供了理論依據(jù)。杜仲藥食兩用補肝腎，富含木脂素類、京尼平苷酸、綠原酸、總黃酮類、氨基酸等營養(yǎng)成分和生物活性成分，能夠促進嗜酸乳桿菌發(fā)酵產生更多的有機酸、甘露聚糖肽和可溶性乳酸鈣，長期食用后有益于人體腸道健康、補鈣和提高免疫力。試驗以香菇為原料，探究添加杜仲對乳酸菌發(fā)酵香菇及其代謝產物的影響，添加三醬和大豆油，輔以香辛料進行炒制，得到一款富含乳酸菌和乳酸鈣的復合風味調味醬。

1.1 材料與設備

香菇（三門峽市永輝超市）；豆醬（海天黃豆醬）；豆豉（靈寶鄉(xiāng)親食品廠）；甜面醬（陜州甜面醬）；杜仲。

嗜酸乳桿菌標準菌株（中國微生物菌種保藏中心CCIC 22162嗜酸乳桿菌）。

7820A氣相色譜儀（美國安捷倫）；BHC-1300ⅡA/B3生物潔凈安全柜（吳江市凈化設備總廠）；DHZC全溫振蕩器（太倉豪誠實驗儀器廠）；PHS-3C型pH計（上海精密科雷磁儀器有限公司）；1.0 m2冷凍干燥設備（上海東富龍科技股份有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳桿菌發(fā)酵劑的制備

1.2.11 培養(yǎng)基的制備

稱取10 g蛋白胨、10 g牛肉膏、5 g酵母膏、5 g氯化鈉、10 g葡萄糖和10 g碳酸鈣，加水至1 000 mL；加熱90 ℃溶解后用20%氫氧化鈉溶液調整pH 6.8，分別裝入試管和三角瓶（斜面試管培養(yǎng)基另外加1%～2%的瓊脂），分別將棉塞和防潮紙進行包扎；于120 ℃蒸汽滅菌25 min，冷卻后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中備用。

1.2.12 活化培養(yǎng)

將標準品菌種轉入液體試管培養(yǎng)基，置恒溫培養(yǎng)箱37 ℃活化培養(yǎng)24 h；將生長良好的液體試管，用鉑金餌鉤取菌液，劃線斜面數(shù)支或數(shù)十支，置恒溫培養(yǎng)箱于37 ℃培養(yǎng)24 h，取菌苔生長良好的作為生產用斜面菌種，放置冰箱備用；每天取1支斜面菌種，分別接種1級試管和2級三角瓶培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h；將生長良好的三角瓶（2級）液體發(fā)酵培養(yǎng)基轉接5 000 mL圓底燒瓶（配制3 000 mL）10%脫脂牛奶混合培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基添加7%～8%蔗糖，1%谷氨酸、1%維生素C和1%碳酸鈣作為保護劑和緩沖劑，同樣置恒溫培養(yǎng)箱于37 ℃培養(yǎng)16 h，每隔1 h搖瓶1次，并觀察碳酸鈣消失情況。

1.2.13 凍干制劑

發(fā)酵終點pH 4.0時，將3級培養(yǎng)發(fā)酵液置真空冷凍干燥機組，于-45～50 ℃進行真空冷凍干燥并按無菌操作程序收集凍干菌粉稱量，即得嗜酸乳酸桿菌發(fā)酵劑。

1.2.2 添加杜仲的乳桿菌發(fā)酵劑的制備

杜仲提取物的制備：定量稱取杜仲葉（揉碎），按1︰1加入純凈水浸潤2 h，第1次料液比按1︰6（g/mL）加入純凈水，控制加熱溫度95 ℃加熱提取1 h，第2次料液比按 1︰4（g/mL）加入純凈水，控制加熱溫度95 ℃加熱提取40 min；合并2次提取液，然后放置真空冷凍干燥機組，于-50 ℃進行真空冷凍干燥并按無菌操作程序收集凍干粉，即得杜仲提取物。培養(yǎng)基的制備過程添加10 g杜仲提取物，其余操作同1.2.1。

1.2.3 工藝流程

CCIC 22162嗜酸乳桿菌標準菌種活化、篩選、斜面保藏→轉一級、二級杜仲提取物強化培養(yǎng)→低溫冷凍干燥乳酸菌高效發(fā)酵劑→接種香菇丁固態(tài)發(fā)→45 ℃低溫混合攪拌炒制好的三醬→乳酸菌發(fā)酵杜仲香菇復合調味醬

1.2.4 添加杜仲對發(fā)酵香菇的影響

分別將未經杜仲提取物強化的嗜酸乳桿菌發(fā)酵劑和添加杜仲提取物的嗜酸乳桿菌發(fā)酵劑加入香菇丁的水溶液中，香菇與水質量比1︰1，發(fā)酵劑接種量為香菇質量的8%。調節(jié)pH 6.8，在37 ℃發(fā)酵120 h，每隔24 h測定發(fā)酵液中的活菌總數(shù)、pH和乳酸鈣含量。

1.2.5 發(fā)酵香菇復合調味醬的工藝優(yōu)化

三醬（豆瓣醬、甜面醬、豆豉）按1︰1︰1的配比進行炒制，炒出紅油后，5 min后，依次放入稱好的辣椒、洋蔥和大蒜、花椒、白糖；油溫達到190 ℃時，加入稱好的食鹽和味精進行加溫，把溫度慢慢升到260 ℃時，關火炒制；油溫降到80 ℃后，把溫度慢慢升到230 ℃，炒出醬香味持續(xù)炒5 min，關火降溫，降溫至45 ℃。加入預先發(fā)酵好的香菇丁充分混合均勻后，即為發(fā)酵香菇醬。

基礎配方：發(fā)酵香菇56%，三醬（甜面醬、豆瓣醬、豆豉質量比1︰1︰1）25%，大豆油8%，辣椒、味精、洋蔥、大蒜各2%，花椒、白糖、食鹽各1%。

分別選取發(fā)酵香菇添加量（48%，52%，56%，60%和64%）、三醬添加量（19%，21%，23%，25%和27%）和大豆油添加量（6%，7%，8%，9%和10%）為3個變量，進行單因素試驗。

在單因素試驗基礎上，以發(fā)酵香菇添加量、三醬添加量和大豆油添加量為三因素，以感官評分為指標，進行響應面試驗研究，因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素與水平表 單位：%

1.2.6 感官評分

由10名食品專業(yè)人士組成感官評定小組，對香菇醬進行色澤、口感、氣味和組織狀態(tài)進行評定[15]，評分標準見表2。

表2 感官評分標準

1.2.7 營養(yǎng)成分的測定和理化指標

蛋白質按照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》測定；脂肪按照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》測定；膳食纖維按照GB 5009.88—2014《食品安全國家標準食品中膳食纖維的測定》測定；水分按照GB 5009.3—2010《食品安全國家標準 食品中水分的測定》測定；灰分按照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》測定；碳水化合物按照GB 28050—2011《預包裝食品營養(yǎng)標簽通則》計算獲得，碳水化合物=100-蛋白質、脂肪、水分、灰分、膳食纖維的質量；乳酸菌活菌數(shù)按照GB 4789.35—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》測定；乳酸鈣按照GB 5009.92—2016《食品安全國家標準 食品中鈣的測定》測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復3次，試驗結果采用“平均值±標準偏差”表示；試驗結果用Origin 9.0軟件進行處理和繪圖；響應面試驗使用Design-Expert 7.0.0設計分析。

2 結果與分析

2.1 添加杜仲前后香菇發(fā)酵變化

2.1.1 添加杜仲前后活菌總數(shù)隨時間的變化

以發(fā)酵時間為橫坐標，以活菌總數(shù)的對數(shù)為縱坐標，活菌總數(shù)隨時間的變化見圖1。結果表明，接種24 h內，活菌數(shù)量急劇下降，這是因為發(fā)酵劑中的嗜酸乳桿菌剛進入新的發(fā)酵環(huán)境不適應。24 h后，隨著發(fā)酵時間的增加，活菌總數(shù)逐漸增加。96 h時，活菌總數(shù)最多，添加杜仲提取物的發(fā)酵液中乳酸菌總數(shù)6.4×108CFU/g，未添加杜仲提取物的發(fā)酵液中乳酸菌總數(shù)為2.8×108CFU/g，這說明添加杜仲提取物對發(fā)酵有促進作用。與賈亞娟等[16]的研究相比，活菌數(shù)達到最大所需時間較長，這可能是由于發(fā)酵初期香菇丁顆粒較大，嗜酸乳桿菌不能很好地利用。24 h后，活菌適應環(huán)境，呈對數(shù)生長趨勢。96 h后，由于營養(yǎng)物質減少和次級代謝產物的增多，營養(yǎng)物質缺乏，乳酸菌活菌總數(shù)呈減小趨勢。

圖1 添加杜仲前后菌數(shù)隨時間的變化

2.1.2 添加杜仲前后pH隨時間的變化

添加杜仲前后pH隨時間的變化結果見圖2。結果表明，隨著發(fā)酵時間的增加，乳酸等有機酸發(fā)酵產物增加，pH逐漸降低，發(fā)酵96 h，pH下降至3.8。0～24 h，pH下降速度明顯低于24～72 h；96～120 h，pH不再下降。

圖2 添加杜仲前后pH隨發(fā)酵時間的變化

2.1.3 添加杜仲前后乳酸鈣隨時間的變化

以發(fā)酵時間為橫坐標，可溶性乳酸鈣含量變化結果見圖3。結果表明，隨發(fā)酵時間的增加，乳酸鈣含量先增加后趨于穩(wěn)定。發(fā)酵96 h時，乳酸鈣含量最高，添加杜仲提取物的發(fā)酵液中乳酸鈣含量可達2.2%，未添加杜仲提取物的發(fā)酵液中乳酸鈣含量為2.1%，添加杜仲提取物能增加發(fā)酵液中的乳酸鈣含量，但增量較小。120 h后乳酸鈣含量不再增加，這說明整個發(fā)酵體系不再產酸，乳酸鈣產量達到飽和狀態(tài)，這與pH變化的結果一致。

圖3 添加杜仲前后乳酸鈣隨發(fā)酵時間的變化

2.2 調味工藝單因素試驗結果

2.2.1 發(fā)酵香菇添加量對香菇復合調味醬感官評分的影響

發(fā)酵香菇添加量對香菇復合調味醬感官評分的影響見圖4。結果表明，隨著發(fā)酵香菇添加量的增加，感官評分先增加后減少，發(fā)酵香菇添加量56%時感官評分最高。發(fā)酵香菇中含有大量的乳酸、酸味氨基酸、鮮味氨基酸和芳香味氨基酸[17]。發(fā)酵香菇添加過少，鮮味香味不足；發(fā)酵香菇添加過多，酸味過重，遮蓋了產品的其他風味，評分降低。

圖4 發(fā)酵香菇添加量對感官評分的影響

2.2.2 三醬添加量對產品品質的影響

三醬添加量對產品品質的影響見圖5。三醬添加量低于23%，由于添加量過少，調節(jié)酸味的作用較低，復合調味醬口感較差。三醬添加量高于23%時，咸味偏大，評分降低。

圖5 三醬添加量對感官評分的影響

2.2.3 大豆油添加量對產品品質的影響

大豆油添加量對產品品質的影響見圖6。隨著大豆油的添加量的增加，感官評分先增加后減少。大豆油含量低于8%，香味物質較少；大豆油含量高于8%時，復合調味醬偏膩，評分降低，口感較油膩，也不利于人體健康。因此，大豆油最佳添加量為8%。

圖6 大豆油添加量對感官評分的影響

2.3 響應面試驗設計及感官評分結果

響應面試驗的感官評分見表3。發(fā)酵香菇復合調味醬的感官評分與3個因素的回歸方程式為Y=87.80+1.56A+0.13B+0.44C-1.88AB-0.75AC+1.12BC-2.15A2-3.53B2-1.40C2。由表4可知，回歸模型中R2為0.997 2，P＜0.000 1，說明模型擬合度高，可靠性好，可以用此方程預測3個因素對發(fā)酵香菇復合調味醬感官評分。由一次項式F值可知，各因素對發(fā)酵香菇復合調味醬的感官評分影響依次為發(fā)酵香菇添加量＞大豆油添加量＞三醬添加量。

表3 響應面試驗的感官評分

表4 響應面模型方差分析

2.4 最佳工藝條件試驗驗證

通過響應面優(yōu)化，系統(tǒng)推測出發(fā)酵香菇復合調味醬的最佳工藝，即香菇添加量58%、三醬添加量23%、大豆油添加量8%，感官評分為88分。經過3次驗證，實際感官評分為88分。

2.5 發(fā)酵復合調味醬的營養(yǎng)成分及理化指標

發(fā)酵香菇復合調味醬的營養(yǎng)成分見表5。發(fā)酵香菇復合調味醬含有豐富的蛋白質和膳食纖維，且含有1.2%的乳酸鈣。發(fā)酵香菇復合調味醬在提供人體必需的能量物質的同時，還可以補充鈣元素。此外，乳酸菌活菌數(shù)可達4.0×108CFU/g，可以調節(jié)人體腸道功能，有益人體健康。發(fā)酵香菇復合調味醬是一款新型健康的調味食品。為更好保持乳酸菌的活菌數(shù)量和營養(yǎng)成分，這款產品需在0～4 ℃冷藏保存。

表5 香菇醬中營養(yǎng)成分及含量

3 結論

乳酸菌發(fā)酵劑在添加杜仲提取物后，發(fā)酵香菇的活菌數(shù)量增加1倍，這說明添加杜仲提取物對香菇發(fā)酵有強化作用。發(fā)酵杜仲香菇復合調味醬的最佳配方為發(fā)酵香菇添加量58%，三醬添加量23%，大豆油添加量8%。按此配方下得到的乳酸菌香菇醬色澤紅潤，香味濃郁，營養(yǎng)和安全指標均符合國家標準，且富含乳酸菌和乳酸鈣。