陳英賀，張柳葉，侯 順，繆德仁

(昆明學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，云南 昆明 650214)

飲茶不僅經(jīng)濟(jì)實(shí)惠而且還具有傳統(tǒng)價(jià)值、精神價(jià)值以及非酒精藥用價(jià)值[1].目前，飲茶人數(shù)已約占全球總?cè)丝诘?7%，每天消費(fèi)高達(dá)20億杯之多[2].茶葉中不僅富含有助于延緩衰老、降低心臟病和冠心病等對(duì)人體有益的活性成分，而且還富含礦質(zhì)元素.在眾多的礦質(zhì)元素中，有些元素(如銅、鐵、錳、鋅等)可維持人體免疫系統(tǒng)、骨骼健康和神經(jīng)功能[3]，而有些元素(如鎘、鉛和汞等)則可抑制血紅素和細(xì)胞色素的生成，對(duì)腎、腦、骨骼、血液等產(chǎn)生毒性并致癌[4].近年來(lái)，隨著人類活動(dòng)的加劇和生活水平的提高，消費(fèi)者對(duì)茶葉礦質(zhì)元素含量的關(guān)注度逐年上升，許多國(guó)家均頒布了限定茶葉中金屬元素含量的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[5].

目前，絕大部分關(guān)于茶葉中有毒有害元素的限量標(biāo)準(zhǔn)均僅規(guī)定了該元素在茶葉中總量的限定值，實(shí)際上，飲用茶湯依然是其主要的食用方式.基于此，研究者對(duì)茶葉和茶湯中礦質(zhì)元素的飲用風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了大量的評(píng)估.Idrees等[4]對(duì)開伯爾-普赫?qǐng)D赫瓦的市售茶葉進(jìn)行健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估.結(jié)果顯示茶葉中銅的估計(jì)日攝入量(estimated daily intake，EDI)值高于口服參考劑量(reference dose，RfD)值，表明該些市售茶葉存在著潛在的健康風(fēng)險(xiǎn).Pourramezani等[6]對(duì)印度紅茶和斯里蘭卡紅茶的健康風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了評(píng)價(jià).結(jié)果表明，與斯里蘭卡紅茶相比，印度紅茶的目標(biāo)危險(xiǎn)系數(shù)(target hazard quotient，THQ)和危險(xiǎn)指數(shù)(hazard index，HI)值更高.繆德仁等[7]對(duì)云南鳳慶茶葉中銅、鉛、鋅、鎘、鉻和砷的健康風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了評(píng)估.結(jié)果表明，鳳慶茶葉中各重金屬元素EDI的平均值由大到小的順序?yàn)椋篍DI(Zn)>EDI(Cu)>EDI(Cr)>EDI(Pb)>EDI(As)，各重金屬元素的HI均小于1，無(wú)健康風(fēng)險(xiǎn).需要指出的是，茶葉重金屬含量的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是一項(xiàng)復(fù)雜的任務(wù)，需要綜合考慮消費(fèi)模式、消費(fèi)頻率、浸出率、人口統(tǒng)計(jì)和接觸時(shí)間等各種因素.

茶葉中礦質(zhì)元素的可浸出量是衡量茶葉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的重要指標(biāo).基于此，目前國(guó)內(nèi)外研究者在茶葉中礦質(zhì)元素的浸出特征方面進(jìn)行了大量的研究.彭群華等[8]對(duì)市售冷泡茶中主要品質(zhì)成分的浸出規(guī)律進(jìn)行了研究.結(jié)果表明，沖泡方式顯著影響著茶多酚、氨基酸和咖啡堿的溶出.劉銳[9]對(duì)浸泡溫度的影響進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，浸泡溫度對(duì)金屬元素溶出量的影響不一.段曉艷等[10]對(duì)浸泡時(shí)間進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，茶湯中Co，F(xiàn)e，Ni和Sr的濃度與浸泡時(shí)間呈正相關(guān)，Cu與浸泡時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，而Cr，Pb和Zn與浸泡時(shí)則無(wú)明顯的相關(guān)性.總體而言，浸泡次數(shù)、浸泡時(shí)間、浸泡溫度等均對(duì)礦質(zhì)元素的浸出具有一定的影響，但不同元素的影響不一，這主要與各元素在茶葉中的賦存形態(tài)有關(guān).根據(jù)相似相溶原理，小極性提取劑可有效提取小極性類化合物，強(qiáng)極性提取劑可有效提取中-強(qiáng)極性化合物，而水及鹽類水溶液則可有效提取離子型/態(tài)等水溶性物質(zhì).目前鮮見有關(guān)采用不同極性提取劑對(duì)茶葉中礦質(zhì)元素的提取率進(jìn)行研究的相關(guān)報(bào)道.實(shí)際上，查明茶葉礦質(zhì)元素在不同極性提取劑中的浸出特征可為其在茶葉中的賦存形態(tài)研究提供理論支持[11].基于此，本研究選取正己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇和水為提取劑，對(duì)云南大葉種茶葉中的Al、As、B、Cd、Cr、Cu、Mn、Ni、Pb、Sb、Zn和Ge的提取特征進(jìn)行研究，以期為該些元素在茶葉中的賦存形態(tài)研究提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 茶葉樣品的采集及制備

本研究以2022年10月采集自云南臨滄大田河茶園(99°59′21″E；23°50′26″N)的茶葉鮮葉(一芽二至三葉)為研究對(duì)象.茶葉鮮葉經(jīng)清洗(自來(lái)水)、烘干(60 ℃)并研磨至全部過20目尼龍孔篩.茶葉中的礦質(zhì)元素含量采用微波消解-ICP-MS進(jìn)行測(cè)定[12]，供試茶葉中礦質(zhì)元素的含量列于表1之中.

表1 供試茶葉中礦質(zhì)元素的含量 mg/kg

1.2 礦質(zhì)元素的浸提

本研究選取極性不同的正己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇和水為提取劑，具體提取步驟為：準(zhǔn)確稱取 50.000 g 茶葉樣品于索氏提取器(配 1 L 接液圓底燒瓶)的提取筒(內(nèi)置纖維濾筒)中，依次分別采用 700 mL 的浸提劑(正己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇和水)進(jìn)行連續(xù)加熱回流-虹吸提取至索氏提取裝置內(nèi)溶液為無(wú)色(6～8 h)，提取液分別經(jīng)濃縮-蒸干(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā))、烘干(60 ℃)后稱量所得提取物的質(zhì)量(差減法)，將干燥提取物研磨至過100目尼龍孔篩后貼標(biāo)備用.

準(zhǔn)確稱取0.1～0.2 g 提取物質(zhì)于微波消解罐中，分別加入 8 mL 濃HNO3和 2 mL H2O2(30%)，進(jìn)行消解并定容至 10 mL 后采用ICP-MS對(duì)各礦質(zhì)元素進(jìn)行測(cè)定[12].

本研究所用提取劑均為色譜純，若無(wú)特別說明，其余試劑均為優(yōu)級(jí)純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水.由于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的缺乏，本研究并未采用相關(guān)的茶葉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)分析質(zhì)量進(jìn)行控制.每一實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同提取劑提取物的質(zhì)量和提取率

采用不同極性提取劑對(duì)茶葉樣品進(jìn)行索氏提取，提取物的質(zhì)量和提取率匯總于表2之中.

提取結(jié)果表明，經(jīng)正己烷、三氯甲烷和丙酮對(duì) 50.00 g 茶葉提取后，獲得提取物干燥后的質(zhì)量分別為 1.144 9，1.259 3，1.571 9 g，提取率分別為2.29%、2.52%和3.14%，表明茶葉中可溶于小極性有機(jī)溶劑的化合物含量相對(duì)較低.而經(jīng)乙酸乙酯、甲醇和純水提取后，獲得提取物干燥后的質(zhì)量分別為 5.824 5，5.230 9，5.070 0 g，提取率分別為11.65%、10.46%和10.14%.研究[13]表明，乙酸乙酯可有效提取出植物中的黃酮類和多酚類物質(zhì).在本研究中，乙酸乙酯對(duì)茶葉的提取率高達(dá)11.65%，遠(yuǎn)高于正己烷和三氯甲烷，這主要是由于茶葉中茶多酚的含量較高所致[3].大極性提取劑(醇類和水)主要提取植體內(nèi)呈溶解狀態(tài)的無(wú)機(jī)鹽和氨基酸鹽[14].在本研究中，甲醇和水對(duì)茶葉的提取率高達(dá)20%以上(表2)，表明大葉種茶葉提取物的主要成分是無(wú)機(jī)鹽和氨基酸鹽.總體而言，隨著提取劑極性的增大，其對(duì)茶葉的提取能力也逐漸增強(qiáng).

表2 不同提取劑提取物的質(zhì)量和提取率

2.2 不同極性提取劑對(duì)礦質(zhì)元素的提取率

采用微波消解-ICP-MS測(cè)定方法對(duì)不同極性溶劑提取物進(jìn)行消解測(cè)定并計(jì)算各礦質(zhì)元素的提取率，結(jié)果如表3所示.

連續(xù)提取結(jié)果表明，茶葉中各礦質(zhì)元素的總提取率由高到低的排序?yàn)椋篜b>Zn>Cr>Ni>Cd>B≈As>Sb>Cu>Al>Ge>Mn，這與王寶森等[15]的研究結(jié)論基本一致.研究[16]表明，沸水對(duì)茶葉中Mn、Zn和Cu的浸出率分別在17.00%～61.34%、19.39%～48.80%和6.21%～78.11%之間，不同茶葉中礦質(zhì)元素的浸出率差異較大，茶葉種類、浸提溫度，固液比、浸出時(shí)間等因素均影響著茶葉中礦質(zhì)元素的浸出率.在本研究中，盡管Mn和Al的浸出率較低(分別為9.02%和22.53%)，但茶葉中Mn和Al的含量較高(表1)，因此浸出液中Mn和Al的含量也相對(duì)較高.

比較而言，Cr、Ni、Cd、B、A、Sb、Cu、Al、Ge和Mn在甲醇和水中的浸出率均遠(yuǎn)高于正己烷和三氯甲烷，說明該些元素在茶葉中主要以溶解狀態(tài)的無(wú)機(jī)鹽和氨基酸鹽為主；茶葉中Zn的總提取率較高(93.33%)，且不同提取劑的提取率變化不大(除水外)，表明茶葉中的Zn極易被提取出來(lái).分析認(rèn)為，這主要與Zn的金屬活性和其對(duì)茶樹生長(zhǎng)的必需性有關(guān).然而，Pb在小極性和中等極性(乙酸乙酯和丙酮)中的提取率遠(yuǎn)高于大極性浸提劑，說明Pb在茶葉中主要以黃酮類和多酚類結(jié)合態(tài)為主，這主要與Pb對(duì)茶樹的毒性有關(guān)[14].

2.3 礦質(zhì)元素在茶葉中的賦存形態(tài)分析

茶葉中礦質(zhì)元素對(duì)不同極性提取劑的響應(yīng)反映出其賦存形態(tài)的差異.通常認(rèn)為，小極性提取劑可有效提取植物中小極性類化合物，大極性提取劑則可有效提取植物中大極性化合物[13].基于此，本研究將正己烷+三氯甲烷、乙酸乙酯+丙酮、甲醇+水提取的礦質(zhì)元素賦存形態(tài)分別定義為小極性態(tài)、中等極性態(tài)和強(qiáng)極性態(tài)，而未提取出的部分則定義為殘?jiān)鼞B(tài).依據(jù)浸提結(jié)果對(duì)各礦質(zhì)元素在茶葉的賦存形態(tài)進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果如圖1所示.

結(jié)果表明，各礦質(zhì)元素小極性態(tài)的分布比例由高到低的排序?yàn)椋篜b>As>Zn>Cr>Cd>Sb>Cu>Ni>Ge>B>Al>Mn；中等極性態(tài)分布比例較高的是Pb和Cd，較低的是Mn和Al；強(qiáng)極性態(tài)分布比例較高的是B和Cr，較低是Mn；殘?jiān)鼞B(tài)分布比例較高的是Mn和Ge，較低的是Zn.

在植體中，礦質(zhì)元素可以游離態(tài)、有機(jī)物結(jié)合態(tài)、無(wú)機(jī)鹽結(jié)合態(tài)等多種形態(tài)賦存[17].通常認(rèn)為，小極性提取劑提取物以烯烴、烷烴、萜類等小極性有機(jī)物為主的，強(qiáng)極性提取劑提取物以多糖、皂苷、無(wú)機(jī)鹽、氨基酸鹽以及水溶性有機(jī)酸鹽等為主，活性較大；而殘?jiān)鼞B(tài)則難以遷移，活性和毒性均較低[18].研究[19]表明，不同植體中礦質(zhì)元素的賦存形態(tài)比例不一.如Pb在巴戟天中以結(jié)合態(tài)為主，在中草藥(密蒙花、合歡等)中，Zn和Cu則以殘?jiān)鼞B(tài)為主，而小極性態(tài)含量最低；而在瑣陽(yáng)水提液中，Cu、Zn、Fe、Cd和Mn則是以某種形態(tài)為主，多種形態(tài)共存的混雜體系.顯然，礦質(zhì)元素在植體中的賦存形態(tài)比例不僅與其自身性質(zhì)有關(guān)而且還與植體的特性有關(guān).在本研究中，Pb在小極性態(tài)和中等極性態(tài)中的分布比例最高，而Pb和Zn在殘?jiān)鼞B(tài)中的分布比例較低，這可能與Zn的活性較高和Pb對(duì)茶樹的毒性較大有關(guān).

鍺既非植物必需營(yíng)養(yǎng)元素也非環(huán)境劇毒元素，但有機(jī)鍺卻具有較高的活性[20].在本研究中，殘?jiān)鼞B(tài)鍺的分布比例較高(80.76%)，表明茶葉中鍺的活性態(tài)含量較低.需要指出的是，本研究采用不同極性提取劑對(duì)茶葉中的礦質(zhì)元素進(jìn)行連續(xù)提取(索氏提取)，提取的溫度低于沸水，而在日常飲茶過程中，茶湯的沖泡溫度則較高[21].因此，本研究提取出的非殘?jiān)鼞B(tài)鍺的比例應(yīng)低于茶湯.關(guān)于鍺在茶葉中賦存形態(tài)的詳細(xì)信息，有待進(jìn)一步深入研究.

3 結(jié)論

通過以上研究，可以得到如下結(jié)論：

1)Cr、Ni、Cd、B、A、Sb、Cu、Al、Ge和Mn在大葉種茶葉中主要以溶解狀態(tài)的無(wú)機(jī)鹽和氨基酸鹽為主；Pb主要以黃酮類和多酚類物質(zhì)結(jié)合為主，幾乎可以被有機(jī)溶劑提取完全提取，而Zn則主要與有機(jī)酸鹽結(jié)合為主，經(jīng)機(jī)溶劑提取后仍有44.22%的Zn可被純水提取出來(lái)；

2)各礦質(zhì)元素小極性態(tài)的分布比例由高到低的排序?yàn)椋篜b>As>Zn>Cr>Cd>Sb>Cu>Ni>Ge>B>Al>Mn；中等極性態(tài)分布比例較高的是Pb和Cd，較低的是Mn和Al；強(qiáng)極性態(tài)分布比例較高的是B和Cr，較低是Mn；殘?jiān)鼞B(tài)分布比例較高的是Mn和Ge，較低的是Zn；

3)盡管采用不同極性溶劑提取所得的礦質(zhì)元素形態(tài)分布僅具操作意義，但所得結(jié)論可為礦質(zhì)元素在茶葉中形態(tài)分布的深入研究提供數(shù)據(jù)支持.此外，雖然大葉種茶葉中80%以上的鍺主要以殘?jiān)鼞B(tài)賦存，活性態(tài)含量較低.但鑒于有機(jī)質(zhì)具有較高的生物活性，有必要對(duì)茶葉中鍺的賦存形態(tài)分布特征進(jìn)行深入研究.