唐詩琪 唐純麗 林澤云 姜桔紅

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是最常見的肺癌組織學(xué)類型，約占肺癌病例的80%[2]。約70%的肺癌患者因診斷時病情已處于晚期或伴有轉(zhuǎn)移而不能手術(shù)，只能通過小活檢組織或細(xì)胞學(xué)標(biāo)本進(jìn)行診斷[3]。隨著NSCLC驅(qū)動基因研究的進(jìn)展，對于新診斷的晚期NSCLC，需要檢測的治療相關(guān)標(biāo)志物將會進(jìn)一步增加[1-3]，臨床對小活檢標(biāo)本和細(xì)胞學(xué)標(biāo)本輔助分子檢測的需求將持續(xù)增長。目前普遍認(rèn)為福爾馬林固定的石蠟包埋（formalin-fixed paraffin-embedding,FFPE）組織切片是較為可靠的腫瘤分子檢測材料。然而，部分石蠟包埋組織較少，有時進(jìn)行組織學(xué)診斷或補(bǔ)充性的免疫組化檢測之后沒有足夠的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分子檢測，重復(fù)活檢又將增加患者的負(fù)擔(dān)?，F(xiàn)有的研究[4]報(bào)道肺癌小活檢標(biāo)本進(jìn)行第二代測序（next-generation sequencing,NGS）的標(biāo)本合格率只有60%-80%。雖然液態(tài)活檢對分子檢測有一些補(bǔ)充作用，但是存在30%左右的假陰性[5,6]。尋找可靠的組織來源以完成多種檢測方法仍然是臨床病理的一大挑戰(zhàn)。

快速現(xiàn)場評估（rapid on-site evaluation,ROSE）是指在介入活檢操作過程中，對現(xiàn)場獲得的小活檢或細(xì)胞學(xué)標(biāo)本立即進(jìn)行細(xì)胞學(xué)制片、染色、評估，以初步判斷取材是否成功及指導(dǎo)下一步操作和標(biāo)本處理[7,8]。術(shù)中ROSE可提高穿刺成功率，減少穿刺次數(shù)，降低并發(fā)癥。有研究與指南[9-12]推薦，NSCLC分子檢測標(biāo)本可以采用細(xì)胞蠟塊也可以是其他細(xì)胞學(xué)標(biāo)本（直接涂片或液基細(xì)胞學(xué)涂片）。本研究回顧性分析了我院經(jīng)支氣管鏡肺活檢術(shù)（transbronchial forceps lung biopsy,TBLB）或者超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下的經(jīng)支氣管針吸活檢（endobronchial ultrasound transbronchial needle aspiration,EBUS-TBNA）并進(jìn)行了術(shù)中ROSE的NSCLC病例。采用顯微鏡觀察評估所有病例石蠟切片及其配對的ROSE細(xì)胞學(xué)涂片腫瘤細(xì)胞量及比例，以探討ROSE細(xì)胞學(xué)涂片標(biāo)本對NSCLC分子檢測的補(bǔ)充作用。

1 資料與方法

1.1 臨床病例收集 納入2020年8月至2022年12月于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸介入科行TBLB及EBUS-TBNA活檢且術(shù)中行ROSE病例。納入病例的小活檢標(biāo)本均由本院呼吸病理中心完成常規(guī)病理學(xué)檢查并最終診斷為NSCLC。經(jīng)我院的臨床信息系統(tǒng)及病理信息系統(tǒng)查詢并收集每例患者的年齡、性別、標(biāo)本來源及其取材方法以及免疫組織化學(xué)結(jié)果等信息，調(diào)取每例患者的石蠟切片和ROSE細(xì)胞涂片進(jìn)行質(zhì)量評估。本研究經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院機(jī)構(gòu)審查委員會批準(zhǔn)（審批編號：2021-70；批準(zhǔn)日期：2021年8月16日）。

1.2 ROSE細(xì)胞涂片制作方法 TBLB獲取標(biāo)本后，用鑷子夾住小活檢組織在載玻片上的1-2 cm的橢圓形區(qū)域順時針方向滾涂（組織印片）。EBUS-TBNA獲取標(biāo)本后，用針芯推出組織，并用抽滿空氣的注射器再次吹出套管針內(nèi)殘留的液體，滴一滴于載玻片上，用另一塊玻片垂直方向推動液體（涂片）。每例患者至少制作兩張涂片，涂片后立即采用迪夫染液對空氣晾干的細(xì)胞學(xué)涂片進(jìn)行快速染色，染液系按照世界衛(wèi)生組織（World Health Organization,WHO）推薦的快速染色方法配制[13]。如果前面兩次活檢操作為陽性，后面兩次操作獲取的組織全部留作石蠟切片。

1.3 石蠟切片和ROSE細(xì)胞涂片的腫瘤細(xì)胞量評估 納入的病例均有配對的石蠟組織切片和ROSE細(xì)胞學(xué)涂片。所有病例石蠟組織進(jìn)行診斷性免疫組化連續(xù)切片，對最后一張石蠟切片的腫瘤細(xì)胞數(shù)量和比例進(jìn)行評估。在光學(xué)顯微鏡下觀察整張切片的每一塊小組織，或?qū)⑶衅譃槿舾蓚€區(qū)域，依次計(jì)數(shù)每小塊組織或區(qū)域的腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算腫瘤細(xì)胞總的數(shù)量及比例。ROSE細(xì)胞學(xué)涂片的評估采用光學(xué)顯微鏡從左至右依次觀察涂片所有區(qū)域，計(jì)算腫瘤細(xì)胞總的數(shù)量及比例。

1.4 ROSE細(xì)胞涂片DNA提取 由本研究的實(shí)驗(yàn)人員采用QIAGEN DNA提取試劑盒（DNeasy Blood and Tissue Kit）提取ROSE細(xì)胞涂片標(biāo)本DNA，具體步驟如下：兩張ROSE涂片分別滴90 μL Buffer ATL，覆蓋玻片上有細(xì)胞的區(qū)域，用一次性手術(shù)刀片刮下細(xì)胞，聚攏液體成分，用移液器吸取液體置于1.5 mL離心管中，加入20 μL蛋白激酶K，振蕩混勻，56oC孵育至組織完全裂解后按照試劑盒說明書的操作流程進(jìn)行，最后采用100 μL Buffer AE洗脫獲得DNA，采用超微量分光光度計(jì)測量DNA濃度后儲存于-20oC冰箱中。

1.5 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）技術(shù)及高通量NGS檢測分子突變 本院臨床診療過程中檢測NSCLC患者靶基因突變最常用的兩種平臺有廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司的肺癌9個基因突變實(shí)時定量PCR聯(lián)合檢測試劑盒和北京吉因加檢驗(yàn)所的包含1021個基因的高通量NGS套餐[14,15]。兩種檢測方法均包含美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network,NCCN）指南推薦檢測的9個基因的突變：表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）、BRAF、ERBB2、KRAS基因突變，間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）、ROS1、RET、NTRK1/2/3基因融合、MET基因擴(kuò)增和MET基因14號外顯子跳躍突變。實(shí)時定量PCR要求的最低DNA量是10 ng，NGS要求的最低DNA量是50 ng。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行分析和處理。采用斯皮爾曼相關(guān)性分析ROSE涂片腫瘤細(xì)胞量與DNA提取總量的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征 本研究納入308例患者，中位年齡64歲（30-85歲），其中男性210例，女性98例；TBLB取材標(biāo)本210例，EBUS-TBNA取材標(biāo)本98例。病例均經(jīng)石蠟切片及免疫組織化學(xué)診斷為NSCLC：其中腺癌196例，鱗狀細(xì)胞癌88例，非特殊類型癌24例。

2.2 石蠟組織和ROSE細(xì)胞涂片的腫瘤細(xì)胞數(shù)量及比例 根據(jù)每張石蠟切片的腫瘤細(xì)胞數(shù)量和比例，將石蠟組織標(biāo)本分為兩組：不合格組：每張切片＜200個腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞比例＜10%；合格組：每張切片≥200個腫瘤細(xì)胞且腫瘤細(xì)胞比例≥10%。根據(jù)每例患者所有ROSE細(xì)胞涂片的腫瘤細(xì)胞總量和比例對ROSE細(xì)胞涂片標(biāo)本進(jìn)行分組。低量：患者所有ROSE涂片細(xì)胞總量＜1000個腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞比例＜10%，不滿足分子檢測條件；中量：患者所有ROSE涂片細(xì)胞總量為1000-3000個腫瘤細(xì)胞且腫瘤細(xì)胞比例≥10%，滿足分子檢測條件；高量：每例患者所有ROSE涂片細(xì)胞總量＞3000個腫瘤細(xì)胞且腫瘤細(xì)胞比例≥10%，非常適合于分子檢測。在308例ROSE涂片標(biāo)本中，低量組98例，中量組146例，高量組64例；分析發(fā)現(xiàn)TBLB組和EBUS-TBNA組ROSE細(xì)胞涂片分子檢測合格率分別為76.2%和51.0%（表1）。

表1 TBLB和EBUS-TBNA標(biāo)本的配對的FFPE切片和ROSE腫瘤細(xì)胞量的分組詳細(xì)情況Tab 1 Cellularity and adequacy rate of paired FFPE section and ROSE smears in TBLB and EBUS-TBNA

2.3 ROSE細(xì)胞涂片樣本對石蠟切片分子檢測合格率的補(bǔ)充作用 在210例TBLB標(biāo)本中，兩種標(biāo)本結(jié)合使用的情況下，合格率由71.0%提高至90.5%。在98例EBUS-TBNA標(biāo)本中，兩種標(biāo)本結(jié)合使用的情況下，合格率由82.7%提高至85.7%（表2）。圖1展示了石蠟包埋切片與ROSE的細(xì)胞學(xué)特征。

圖1 FFPE切片的組織學(xué)特征與ROSE的細(xì)胞學(xué)特征。A、B：僅少量供診斷的腫瘤細(xì)胞存在于HE染色的石蠟包埋切片；C、D：較多腫瘤細(xì)胞存在于迪夫染色的ROSE組織印片。Fig 1 Histology characterization of FFPE tissue section and cytomorphology of ROSE.A,B shows the HE-stained FFPE tissue section for only the diagnostic tiny tumor tissue;C,D is the Diff-Quik-stained ROSE touch preparations of the same case showing abundant tumor cell clusters or clumps on the slide.A and C: Original magnification ×100;B and D: Original magnification ×400.HE: hematoxylin-eosin.

表2 ROSE細(xì)胞涂片樣本對FFPE切片分子檢測合格率的補(bǔ)充作用Tab 2 Supplemental effect of ROSE smear samples on the adequacy rate of molecular detection in FFPE sections

2.4 ROSE細(xì)胞涂片標(biāo)本的DNA 提取量 TBLB組210例ROSE細(xì)胞涂片提取的DNA量中位數(shù)為17.4ng（0-423.7ng），DNA量＞10 ng（實(shí)時定量PCR檢測要求的最低DNA 量）的病例占74.3%（156/210），＞50 ng（NGS檢測要求的最低DNA量）的病例占16.7%（35/210）。EBUS-TBNA 組98例ROSE細(xì)胞涂片提取的DNA量中位數(shù)為12.65 ng（0-158.4 ng），DNA量＞10 ng的病例占61.2%（60/98），＞50 ng的病例占9.2%（9/98）。采用斯皮爾曼相關(guān)性分析ROSE涂片腫瘤細(xì)胞量與DNA提取總量的關(guān)系，結(jié)果表明，ROSE涂片腫瘤細(xì)胞量與DNA提取總量具有顯著相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)rho值=0.792，P＜0.001），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ROSE細(xì)胞涂片腫瘤細(xì)胞量高，提取的DNA總量高（表3）。

表3 ROSE細(xì)胞涂片腫瘤細(xì)胞量與DNA總量的相關(guān)性Tab 3 The correlation between cellularity and DNA yield of ROSE smears from TBLB and EBUS-TBNA

2.5 分子檢測結(jié)果 在標(biāo)本收集過程中，有92例患者的石蠟組織標(biāo)本遵照醫(yī)囑進(jìn)行了肺癌9個基因突變實(shí)時定量PCR聯(lián)合檢測，有38例患者的石蠟組織標(biāo)本遵照醫(yī)囑進(jìn)行了NGS檢測，我們從這些病例配對ROSE細(xì)胞涂片標(biāo)本中為兩種檢測方法各挑選了5例腫瘤細(xì)胞量合格的ROSE細(xì)胞涂片標(biāo)本進(jìn)行了相同的檢測。在這10例配對標(biāo)本中，石蠟組織中檢測到的所有驅(qū)動突變均在其配對的ROSE細(xì)胞涂片標(biāo)本中檢測到。44例石蠟組織不合格但其配對的ROSE細(xì)胞涂片合格標(biāo)本中，8例提取的DNA量＜10 ng，25例DNA量為10-50 ng，11例提取的DNA量＞50 ng，DNA量＞50 ng的11例標(biāo)本進(jìn)行了NGS檢測，11例標(biāo)本均檢測到體細(xì)胞突變，其中9例檢測到驅(qū)動基因突變（表4）。DNA量為10-50 ng的25例標(biāo)本進(jìn)行了肺癌9個基因突變實(shí)時定量PCR聯(lián)合檢測，其中15例檢測到驅(qū)動基因突變（表5）。

表4 FFPE切片組織不合格但其配對ROSE細(xì)胞涂片合格標(biāo)本NGS突變詳細(xì)情況Tab 4 Mutation details of NGS of samples that were inadequate for FFPE sections but were adequate for paired ROSE cell smears

表5 FFPE切片組織不合格但其配對ROSE細(xì)胞涂片合格標(biāo)本PCR檢測突變詳細(xì)情況Tab 5 Mutation details of PCR of samples that were inadequate for FFPE sections but were adequate for paired ROSE smears

3 討論

相關(guān)驅(qū)動基因突變的分子檢測已成為多種癌癥的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。隨著靶向治療藥物種類的增加，臨床對小樣本（包括細(xì)胞學(xué)標(biāo)本和小活檢）輔助分子檢測的需求將持續(xù)增長。對于肺癌尤其如此，因?yàn)樵S多肺癌患者就診時已經(jīng)是疾病晚期，無法進(jìn)行手術(shù)治療。我們經(jīng)常面臨在相對較少的樣本上進(jìn)行分子檢測的挑戰(zhàn)。目前，所有腫瘤標(biāo)本的病理診斷方法，包括形態(tài)分型、免疫組織化學(xué)和分子分型幾乎全是依賴于FFPE組織切片。其他形式的標(biāo)本，例如直接涂片、液基細(xì)胞學(xué)涂片及ROSE細(xì)胞學(xué)涂片被利用的程度不高。如何通過微創(chuàng)手術(shù)獲得足量標(biāo)本以進(jìn)行組織學(xué)診斷和分子分型，從而精準(zhǔn)指導(dǎo)后續(xù)治療，是臨床醫(yī)師和病理科工作人員面臨的關(guān)鍵問題。

組織印片或針吸細(xì)胞學(xué)涂片結(jié)合迪夫快速染色法的ROSE技術(shù)已逐步發(fā)展成為介入學(xué)科的重要輔助手段，特別是在呼吸系統(tǒng)疾病的診斷中。ROSE可以對標(biāo)本進(jìn)行現(xiàn)場解讀，迅速給出初步診斷，并對下一步操作給予指導(dǎo)。ROSE優(yōu)化了常規(guī)支氣管鏡、EBUS-TBNA和經(jīng)皮肺穿刺等活檢手段的診斷效能和準(zhǔn)確性。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)大部分NSCLC患者TBLB及EBUS-TBNA的ROSE細(xì)胞學(xué)涂片有豐富的腫瘤細(xì)胞，利用合格的ROSE涂片進(jìn)行分子檢測的準(zhǔn)確性等同于或優(yōu)于石蠟組織標(biāo)本。它可以作為石蠟組織標(biāo)本的重要的補(bǔ)充標(biāo)本，也可以與患者的石蠟組織標(biāo)本或其他細(xì)胞學(xué)標(biāo)本結(jié)合使用。

Harada等[7]研究表明，單獨(dú)采用細(xì)胞蠟塊時，針吸標(biāo)本的分子檢測合格率僅為36%，增加迪夫快速染色的細(xì)胞學(xué)涂片標(biāo)本后，分子檢測合格率提高到68%。Fielding等[8]研究表明EBUS-TBNA標(biāo)本的迪夫快速染色的細(xì)胞學(xué)涂片提取的DNA量及分子檢測合格率比對應(yīng)的組織蠟塊高，細(xì)胞涂片與石蠟切片標(biāo)本檢出的突變數(shù)量相當(dāng)。33例配對標(biāo)本中，共有10例檢出驅(qū)動基因突變，其中8例在細(xì)胞涂片和石蠟切片標(biāo)本中均有檢出，1例僅在細(xì)胞涂片標(biāo)本中檢出，1例僅在石蠟切片標(biāo)本中檢出；有24例共檢出41個非驅(qū)動基因突變，其中20例的29個非驅(qū)動基因突變在細(xì)胞涂片和石蠟切片均檢測出，3例的8個非驅(qū)動基因突變僅在細(xì)胞涂片中檢出，4例的4個非驅(qū)動基因突變僅在石蠟切片中檢出。有研究[8]認(rèn)為腫瘤細(xì)胞數(shù)量＞1000且腫瘤細(xì)胞比例≥25%的細(xì)胞涂片標(biāo)本預(yù)示可以獲取高量的DNA并成功進(jìn)行NGS，本研究也證實(shí)了這個觀點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，與石蠟切片相比，采用ROSE細(xì)胞涂片進(jìn)行分子檢測有三方面的優(yōu)勢：（1）從細(xì)胞涂片提取DNA在操作步驟上可省去石蠟包埋、切片、刮片、脫蠟等過程，可減少分子檢測流程的時間。（2）ROSE細(xì)胞涂片具有“所見即所得”的優(yōu)點(diǎn)，載玻片上觀察到的腫瘤細(xì)胞都可用來提取DNA，評估的腫瘤細(xì)胞量能更好地預(yù)示后續(xù)分子檢測的成功。而石蠟組織只能通過觀察表面的一張切片進(jìn)行腫瘤細(xì)胞量的評估，這并不能真實(shí)反映深層組織連續(xù)多次切片后的腫瘤細(xì)胞量。（3）組織在福爾馬林固定過程中，核酸與福爾馬林形成加和物，影響DNA質(zhì)量，導(dǎo)致獲得的DNA量明顯減少，并且為片段化的DNA。而細(xì)胞涂片標(biāo)本未經(jīng)福爾馬林固定，能獲得更高質(zhì)量的DNA[16,17]。另外，石蠟組織的4-5 μm切片只能代表細(xì)胞的一個切面，不能代表完整的細(xì)胞，而細(xì)胞涂片為完整的細(xì)胞。所以從細(xì)胞涂片提取的DNA質(zhì)量優(yōu)于石蠟切片提取的DNA，分子檢測要求的最低DNA量減少5-8倍時仍可獲得滿意結(jié)果[18]。目前各種分子檢測平臺包括實(shí)時定量PCR法及NGS法，標(biāo)本合格的要求不僅包括最低腫瘤細(xì)胞量還包括最低腫瘤細(xì)胞比例。腫瘤細(xì)胞量或腫瘤細(xì)胞比例過低都可導(dǎo)致假陰性結(jié)果[11,19-22]。因此，在分子檢測標(biāo)本的選擇過程中，從腫瘤細(xì)胞比例方面考慮，一些病例的ROSE細(xì)胞涂片標(biāo)本會優(yōu)于其對應(yīng)的石蠟切片標(biāo)本。應(yīng)用ROSE細(xì)胞涂片作為替代的樣本進(jìn)行分子檢測后，相應(yīng)的石蠟切片標(biāo)本可用做更合適的檢測，例如免疫組化檢測ALK、ROS1和細(xì)胞程序性死亡配體1（programmed cell death ligand 1,PD-L1）的表達(dá)，熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization,FISH）檢測基因融合、重排或基因擴(kuò)增。

Tong等[23]研究了肺芯針穿刺標(biāo)本的ROSE細(xì)胞涂片和配對石蠟切片腫瘤細(xì)胞量，發(fā)現(xiàn)ROSE的組織印片技術(shù)可影響后續(xù)石蠟組織的腫瘤細(xì)胞量，導(dǎo)致部分病例的ROSE細(xì)胞涂片上黏附有較多的腫瘤細(xì)胞，而石蠟組織切片僅有少量或無腫瘤細(xì)胞殘留。進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)[24]證實(shí)，印片操作過程中太過用力或組織拖行過長，可導(dǎo)致石蠟組織提取的DNA量減少25%以上。因此ROSE印片操作過程中要避免用力過大，以免耗竭組織中的腫瘤細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)，采用組織印片的TBLB標(biāo)本有相當(dāng)一部分病例存在石蠟切片腫瘤細(xì)胞量少而ROSE細(xì)胞涂片腫瘤細(xì)胞量多的情況。而采用涂片的EBUS-TBNA標(biāo)本這種情況較少。因此選擇分子檢測標(biāo)本時要注意綜合考慮石蠟組織和細(xì)胞涂片這兩種標(biāo)本，單選用石蠟組織而不采用ROSE細(xì)胞涂片可能導(dǎo)致部分患者無足夠的標(biāo)本進(jìn)行分子檢測，特別是采用組織印片技術(shù)的TBLB活檢標(biāo)本。

本研究的不足之處在于，我院呼吸介入科只在部分TBLB及EBUS-TBNA小活檢術(shù)中行ROSE檢測，本研究為回顧性研究，收集的為非連續(xù)性病例，有可能存在抽樣偏差。未來有必要開展前瞻性的連續(xù)病例研究，全面地評估ROSE操作對小活檢標(biāo)本石蠟切片的影響及ROSE細(xì)胞涂片對分子檢測的補(bǔ)充作用。另外，本研究僅對10例配對的石蠟切片和ROSE細(xì)胞涂片標(biāo)本進(jìn)行分子檢測，初步說明ROSE細(xì)胞涂片與石蠟切片分子檢測的結(jié)果相同。有必要增加配對樣本的分子檢測，進(jìn)一步明確這兩種樣本分子檢測的敏感性、特異性。

本研究表明，部分行術(shù)中ROSE的病例存在石蠟切片標(biāo)本腫瘤細(xì)胞量較少，而其細(xì)胞涂片標(biāo)本腫瘤細(xì)胞較豐富。合格的ROSE細(xì)胞涂片進(jìn)行分子檢測的準(zhǔn)確性等同于或優(yōu)于石蠟組織標(biāo)本。采用ROSE細(xì)胞涂片補(bǔ)充石蠟切片標(biāo)本進(jìn)行分子檢測增加了小活檢標(biāo)本分子檢測的標(biāo)本合格率，增加了靶向藥物的分子標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，為更多的患者選擇靶向治療提供了機(jī)會。建議選擇分子檢測標(biāo)本時綜合考慮石蠟組織和細(xì)胞涂片這兩種標(biāo)本。

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

Author contributions

Jiang JH conceived and designed the study.Tang SQ and Lin ZY performed the experiments.Tang SQ analyzed the data.Tang CL provided study material or patients.Jiang JH and Tang CL provided critical inputs on design,analysis,and interpretation of the study.All the authors had access to the data.All authors read and approved the final manuscript as submitted.