陳 海, 任敉宏, 郭曉慶, 李 勇, 李紅燕, 馬 榮, 謝 倩, 王 建△

1成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,西南特色中藥資源國家重點實驗室,中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室,成都 611137 2長治醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,長治 046000 3北京瑞諾眾德科技有限公司,北京 100089

牛黃與冰片均具有“開竅醒神”功效,中醫(yī)臨床中常配伍使用治療中風(fēng),且療效明確。清代蔣介繁《本草擇要綱目》:“凡中風(fēng)入臟者,必用牛雄腦麝之劑,入骨髓、透肌膚、以引風(fēng)出”,其中牛為牛黃,腦為龍腦(即冰片)。

查閱文獻發(fā)現(xiàn)目前牛黃配伍冰片改善腦缺血再灌注(CIRI)的基礎(chǔ)研究鮮見,課題組前期研究證明了牛黃與冰片配伍對腦缺血再灌注模型大鼠的腦保護作用,并基于血管新生探討了其可能的機制,結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥物干預(yù)后缺血側(cè)皮層區(qū)神經(jīng)元及新生血管密度顯著高于溶劑模型組[1]。由于CIRI會導(dǎo)致神經(jīng)組織損傷,主要表現(xiàn)為神經(jīng)元的凋亡[2-3],而中藥具有多成分、多靶點的特點,故作出“牛黃配伍冰片能抑制CIRI后神經(jīng)元凋亡”的推斷。磷酯酰激醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路是細胞重要的存活通路之一,與細胞凋亡關(guān)系密切[4-5]。故本文以PI3K/Akt信號通路為切入點,探討牛黃配伍冰片的腦保護作用是否與抑制腦缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠,體重250～270 g,8～10周齡,由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供,動物許可證號:SCXK(京)2019-0010,動物質(zhì)量合格證號:No.110324200103134075。實驗動物飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心(室內(nèi)溫度控制在23～27 ℃,相對濕度50%左右,且通風(fēng)良好,飼料、飲水自由)。本研究涉及的動物實驗經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn),批準(zhǔn)號TCM-2016-312。

1.2 藥物與試劑

本研究中牛黃使用體外培育牛黃,購于武漢天鵬醫(yī)藥有限公司;三種商品冰片中選擇使用艾片,購于貴州羅甸艾納香藥業(yè)有限公司。尼莫地平片(亞寶藥業(yè)集團股份有限公司,批號190312);注射用青霉素鈉(哈藥集團制藥總廠,批號17121209-2);水合氯醛、吐溫80(成都市科隆化學(xué)品有限公司,批號:2018103001、2019070301);兔抗p-PI3K、PI3K抗體(Abcam,批號:ab182651、ab191606);兔抗p-Akt、Akt抗體(Cell signaling technology,批號:S473、C67E7);兔抗Caspase-3、Bax、Bcl-2抗體(GeneTex,批號:GTX110543、GTX109683、GTX100064);兔抗GAPDH抗體(Affinity,AF7021);Trizol Reagent(北京雷根生物技術(shù)有限公司,批號:NR002)。Tunel Cell Apoptosis Detection Kit(武漢賽維爾生物科技有限公司,批號:G1507)。

1.3 藥物劑量

參照課題組前期研究的計算方法[6],體外培育牛黃的高、中、低劑量分別為0.20、0.10、0.05 g/kg。陽性對照藥物選用尼莫地平,劑量為0.012 g/kg。

1.4 主要儀器

全自動輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(LEICA,RM2255);奧林巴斯光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS BX43,濟南千司生物科技有限公司);高速組織研磨儀(賽維爾,型號KZ-Ⅱ);電泳儀、熒光定量PCR儀(BIO-RAD,型號:1658033、CFX connect);免染型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD,ChemiDoc);微量分光光度計(NanoPhotometer N50 Touch)。

1.5 動物分組及造模方法

1.5.1 動物分組 SPF級雄性SD大鼠52只,適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d,隨機分為假手術(shù)組,模型組,溶劑模型組,尼莫地平(0.012 g/kg)組,體外培育牛黃0.20、0.10、0.05 g/kg組,艾片0.20、0.10、0.05 g/kg組,配伍0.40、0.20、0.10 g/kg組,共13組,每組4只。每天定時稱重并按10 mL/kg體積灌胃,假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水,溶劑模型組給予2%吐溫-80溶液。預(yù)防性給藥第3天灌胃30 min后,改良線栓法制備大腦中動脈阻塞(MCAO)模型,缺血90 min后再灌注,造模成功后,繼續(xù)灌胃給藥3 d,末次灌胃給藥30 min后,脫頸處死大鼠取材。

1.5.2 模型制備 10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠,翻正反射消失后,將其仰臥于手術(shù)臺,四肢固定。采用改良線栓法制備MCAO模型:頸部正中切口,將線栓沿左側(cè)頸總動脈向頸內(nèi)動脈插入20 mm,穿過大腦中動脈(MCA)起始端至大腦前動脈(ACA)近端,缺血90 min后抽出線栓,縫合傷口。大鼠蘇醒后Longa評分≥1分為造模成功。假手術(shù)組僅進行皮膚切開和血管分離操作,不做線栓處理,剩余操作同其他組。

1.6 蘇木精-伊紅(HE)染色

取模型大鼠缺血側(cè)皮層及海馬區(qū)腦組織,10%甲醛固定,石蠟包埋,HE染色。光鏡下(×40,×200)觀察各組大腦皮層的損傷情況,并按以下方法進行半定量比較:無病變,計0分,病變面積小于10%計1分,面積為10%～計2分,30%～計3分,大于50%計4分。使用Image J軟件對200倍鏡下海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元進行計數(shù)。

1.7 Tunel染色觀察皮層神經(jīng)元凋亡

石蠟切片,按Tunel染色試劑盒步驟操作,拍照后400倍光鏡下使用Image ProPlus 6.0軟件對染色陽性細胞進行計數(shù)。凋亡指數(shù)=視野內(nèi)凋亡的神經(jīng)元數(shù)/視野內(nèi)所有神經(jīng)元數(shù)×100%。

1.8 qRT-PCR檢測相關(guān)蛋白mRNA表達

取缺血側(cè)皮層腦組織50 mg,Trizol法提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。美國生物技術(shù)信息中心(NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載大鼠PI3K、Akt、Capase-3、Bax、Bcl-2基因全序列,使用引物軟件(Primer Premier)設(shè)計和篩選引物,引物序列由北京擎科生物科技有限公司合成,各引物序列如表1所示。熒光定量PCR反應(yīng)條件:95 ℃,2 min預(yù)變性;95 ℃變性10 s,55 ℃退火延伸30 s,進行40個循環(huán)。用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平。

表1 引物序列信息

1.9 Western blot法檢測PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白的表達

取缺血側(cè)皮層腦組織50 mg提取總蛋白。BCA蛋白濃度測定試劑盒測定樣品中的蛋白濃度。用PBS及5×Loading buffer稀釋蛋白樣品,SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)。使用5%脫脂奶粉封閉2 h,4 ℃下一抗孵育過夜。TBST洗滌后,孵育二抗,最后使用增強化學(xué)發(fā)光試劑在ChemiDoc成像系統(tǒng)顯影成像。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 對皮層及海馬區(qū)腦組織病理的影響

光鏡40倍和200倍視野下,觀察對腦缺血再灌注模型大鼠海馬、皮層區(qū)的影響,并對皮層區(qū)的損傷及海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元計數(shù)進行半定量分析。由圖1可見,與假手術(shù)組比較,模型組、溶劑模型組的腦皮層損傷評分顯著增加,神經(jīng)元計數(shù)顯著減少(均P<0.01)。與溶劑模型組相比,牛黃3個劑量組,艾片0.20 g/kg組,配伍3個劑量組的皮層損傷得分均顯著降低,海馬CA1區(qū)神經(jīng)元計數(shù)顯著增加(P<0.01或P<0.05)。配伍0.10 g/kg組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元計數(shù)有高于牛黃0.05 g/kg組的趨勢。

與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01;與溶劑模型組比較,#P<0.05,##P<0.01;n=4

綜合前期研究藥效學(xué)及血管新生相關(guān)指標(biāo)結(jié)果[1],選取牛黃0.20 g/kg組(以下簡稱牛黃組)、艾片0.20 g/kg組(以下簡稱艾片組)及配伍0.40 g/kg組(以下簡稱配伍組)進行機制探討。

2.2 對皮層神經(jīng)元凋亡的影響

將MCAO模型大鼠缺血側(cè)大腦皮層組織進行Tunel染色,光鏡(×100,×400)觀察其染色結(jié)果,如圖2所示。與假手術(shù)組相比,溶劑模型組大鼠皮層神經(jīng)元凋亡指數(shù)顯著升高(P<0.01)。與溶劑模型組比較,牛黃組、配伍組皮層神經(jīng)元凋亡指數(shù)顯著降低(均P<0.01)。

1:假手術(shù)組;2:溶劑模型組;3:艾片組;4:牛黃組;5:配伍組;紅色箭頭所指的為凋亡細胞;與溶劑模型組比較,##P<0.01;n=3

2.3 對PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白mRNA表達的影響

采用qRT-PCR技術(shù)檢測缺血側(cè)腦組織中PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白mRNA的表達。

與假手術(shù)組比較,溶劑模型組缺血側(cè)腦組織中PI3K、Akt、Bcl-2 mRNA表達顯著降低,Caspase-3、Bax mRNA表達以及Bax/Bcl-2比值顯著升高(P<0.05或P<0.01)。與溶劑模型組比較,牛黃、艾片及其配伍組均能顯著降低Caspase-3、Bax mRNA表達;配伍組Akt、Bcl-2 mRNA表達顯著升高,Bax/Bcl-2比值顯著降低,且配伍組這一效果顯著優(yōu)于牛黃組(P<0.01)。見圖3。

1:假手術(shù)組;2:溶劑模型組;3:艾片組;4:牛黃組;5:配伍組;與溶劑模型組比較,#P<0.05,##P<0.01;與牛黃組比較,&&P<0.01

2.4 對PI3K/Akt通路蛋白表達的影響

Western blot檢測PI3K/Akt通路p-PI3K、p-Akt、Caspase-3、Bax、Bcl-2的蛋白表達,并計算Bax/Bcl-2比值,結(jié)果如圖4所示。與假手術(shù)組比較,溶劑模型組缺血側(cè)腦組織中p-PI3K、p-Akt及Bcl-2蛋白表達顯著降低,Caspase-3、Bax蛋白表達以及Bax/Bcl-2比值顯著升高(均P<0.01)。與溶劑模型組比較,牛黃、艾片及配伍組均能顯著升高p-PI3K及p-Akt蛋白表達,顯著降低Caspase-3、Bax蛋白表達,降低Bax/Bcl-2比值,配伍組能顯著升高Bcl-2蛋白表達;在升高p-Akt及Bcl-2蛋白與降低Caspase-3蛋白表達方面,配伍組明顯優(yōu)于牛黃組(P<0.05或P<0.01)。

1:假手術(shù)組;2:溶劑模型組;3:艾片組;4:牛黃組;5:配伍組;A:相關(guān)蛋白電泳圖;B～F:p-PI3K、p-Akt、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達水平半定量;G:Bax/Bcl-2比值;與溶劑模型組比較,#P<0.05,##P<0.01;與牛黃組比較,&P<0.05,&&P<0.01

3 討論

PI3K/Akt信號通路與細胞凋亡關(guān)系密切,PI3K活化后,可磷酸化下游的Akt,Akt活化后可促進細胞生存及抑制凋亡:Akt可通過磷酸化mTOR的負調(diào)控因子,從而促進mTOR的活化,促進細胞生存;Akt可磷酸化Caspase-9后減弱Caspase-9的活性,抑制由于Caspase-9活化而引起的級聯(lián)反應(yīng);Akt可直接磷酸化Bcl-2家族蛋白BAD,使BAD不能與Bcl-2和Bcl-X結(jié)合,從而抑制BAD誘導(dǎo)的細胞凋亡;Akt還能磷酸化糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)以抑制其活性,對細胞內(nèi)的能量進行代謝調(diào)節(jié),從而抑制凋亡[4-5];此外,Akt還可磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子,以抑制細胞凋亡,促進細胞的生存:①直接磷酸化Forkhead家族轉(zhuǎn)錄因子。Forkhead家族轉(zhuǎn)錄因子與細胞生存關(guān)系密切,磷酸化的Forkhead可以通過其靶基因而促進細胞生存[6];②與MDM2結(jié)合并磷酸化MDM2,使p53降解或失活,抑制p53誘導(dǎo)的細胞凋亡[7];③直接或間接調(diào)節(jié)NF-κB激酶活性,使NF-κB轉(zhuǎn)移至細胞核并提高其活性,促進NF-κB依賴的生存相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達,從而促進細胞生存[7];④磷酸化環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)和YES相關(guān)蛋白(YAP),增加它們的轉(zhuǎn)錄活性以抑制凋亡。PI3K/Akt信號通路與凋亡的關(guān)系如圖5所示。

圖5 PI3K/Akt信號通路與凋亡的關(guān)系

PI3K/Akt信號通路激活后,還可作用于NF-κB、mTOR、糖原合成酶激酶-3(GSK-3β)、一氧化氮合成酶(NOS)等下游靶點以發(fā)揮抗凋亡作用。①作用于下游靶點NF-κB:研究發(fā)現(xiàn)CXCL8基因沉默可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt下游的NF-κB,抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞損失和凋亡指數(shù)[8];大黃素可抑制人第10號染色體上PTEN基因的表達,激活PI3K/Akt通路,降低NF-κB p50核蛋白轉(zhuǎn)錄水平,從而抑制神經(jīng)細胞凋亡[9];益髓解毒法可激活PI3K/Akt信號通路,通過使大鼠海馬組織內(nèi)NF-κB蛋白和基因表達上調(diào)、使Caspase-3、Caspase-9以及BAD蛋白和基因表達下調(diào),從而發(fā)揮抗凋亡作用[10]。②作用于下游靶點mTOR:曲美汀酸B在體內(nèi)和體外的腦缺血模型中均可通過抑制微小RNA-10a(miRNA-10a)表達,激活PI3K/Akt/mTOR信號通路,從而減少線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡[11]。③作用于下游靶點GSK-3β:激活PI3K-Akt-GSK-3β通路,可降低促凋亡蛋白Bax的表達,升高抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,以發(fā)揮抗凋亡作用[12-13]。堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)處理可激活PI3K/Akt信號通路,通過調(diào)控GSK-3β進而影響Wnt/β-catenin信號通路,從而發(fā)揮抗凋亡作用[14]。④作用于下游靶點NOS:鞣花酸可激活PI3K/Akt信號通路,作用于下游的NOS,降低大鼠缺血側(cè)腦組織促凋亡相關(guān)蛋白(Bax、CytoC、Caspase-3)的水平而具有抗凋亡作用[15]。

另外,激活PI3K/Akt通路,還可以減輕ERS及抑制線粒體介導(dǎo)的凋亡通路以發(fā)揮抗凋亡作用。激活PI3K/Akt通路,可顯著逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元損傷和ERS的細胞凋亡[16-17];激活PI3K/Akt通路,可上調(diào)腦組織中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達和升高Bcl-2/Bax比值,下調(diào)促凋亡蛋白Bax、CytoC、Caspase-9和Caspase-3蛋白表達以發(fā)揮抗凋亡作用[18]。

本實驗研究結(jié)果顯示,體外培育牛黃、艾片及兩藥配伍后顯著減輕缺血側(cè)腦組織病理損傷、減輕缺血側(cè)皮層神經(jīng)元凋亡;可顯著上調(diào)p-PI3K及p-Akt蛋白,下調(diào)Bax、Caspase-3蛋白,降低Bax/Bcl-2比值,表明PI3K/Akt信號通路被激活,體外培育牛黃、艾片及兩藥配伍調(diào)控MCAO模型大鼠的機制可能與激活PI3K/Akt通路、抑制凋亡有關(guān)。體外培育牛黃及配伍組均可上調(diào)p-Akt、Bcl-2表達,下調(diào)Caspase-3表達、降低Bax/Bcl-2比值,且配伍組顯著優(yōu)于牛黃組,一定程度上體現(xiàn)了“相使”增效的配伍關(guān)系。

本研究首次以體外培育牛黃配伍冰片為研究對象,以腦缺血再灌注模型大鼠為載體,闡釋了體外培育牛黃、冰片及二者配伍通過激活PI3K/Akt通路抗神經(jīng)元凋亡而發(fā)揮腦保護作用,可能是其表現(xiàn)出“開竅醒神”功效的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。然而中藥具有多成分多靶點的特點,其是否還與抗炎以及神經(jīng)發(fā)生有關(guān),對腦缺血后期是否具有保護作用等,均有待今后更深入研究。