摘要：采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)結(jié)合分子網(wǎng)絡(luò)，全面快速地分析和鑒定吳茱萸湯中的化學(xué)成分。使用Waters Acquity UPLC HSS T3型色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）進(jìn)行色譜分離，離子源為HESI，在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。隨后，將質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入GNPS平臺(tái)生成分子網(wǎng)絡(luò)對(duì)化合物進(jìn)行分類，再將質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入Compound Discover 3.2軟件進(jìn)一步對(duì)化合物進(jìn)行鑒定。最終在吳茱萸湯中共鑒定出100個(gè)化合物，其中以黃酮類、生物堿類、有機(jī)酸類、萜類、糖類化合物為主，還有少量的苯丙素類、苯酚類、苷類化合物。其分析方法和結(jié)果對(duì)中藥復(fù)雜體系的成分表征具有借鑒價(jià)值。

關(guān)鍵詞：吳茱萸湯;高分辨質(zhì)譜;分子網(wǎng)絡(luò);成分表征

中圖分類號(hào)：R917.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

吳茱萸湯為經(jīng)典中醫(yī)方劑，配方以吳茱萸為主，生姜助之，人參、大棗為輔，四味藥為該方的君臣佐使^［1］，現(xiàn)代常用于治療偏頭痛、嘔吐、消化不良、高血壓、抑郁、心血管等疾病^［2-7］。目前，方中吳茱萸、生姜、人參和大棗各自的化學(xué)成分研究均已有報(bào)道^［3-7］，但關(guān)于吳茱萸湯整方的化學(xué)成分研究鮮有報(bào)道，為了闡明吳茱萸湯中的化學(xué)成分，有必要建立一種可靠有效的分析方法。

中藥的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜、極性相差大且難揮發(fā)，用常規(guī)的分析方法較難實(shí)現(xiàn)對(duì)其化學(xué)成分的全面表征。超高效液相色譜四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-Q-Orbitrap HRMS）技術(shù)可以快速地分析出中藥復(fù)雜體系中化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用。

分子網(wǎng)絡(luò)在全球天然產(chǎn)物社會(huì)分子網(wǎng)絡(luò)（Global natural products social molecular networking， GNPS）數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)建立，依據(jù)結(jié)構(gòu)相似的化合物能產(chǎn)生相似的碎片，通過(guò)算法獲得二級(jí)質(zhì)譜的相似程度，按照相似程度的大小整合在可視化的網(wǎng)絡(luò)中，通過(guò)比較節(jié)點(diǎn)間二級(jí)質(zhì)譜的異同，推導(dǎo)結(jié)構(gòu)類似化合物^［8］。分子網(wǎng)絡(luò)策略在化學(xué)成分定性、定量表征及質(zhì)量控制，指導(dǎo)活性化合物的分離、提取工藝的優(yōu)化以及疾病診斷和個(gè)性化治療等方面具有廣泛應(yīng)用^［9］。因此，本研究采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)結(jié)合分子網(wǎng)絡(luò)，對(duì)吳茱萸湯的化學(xué)成分進(jìn)行分析，為吳茱萸湯的藥效物質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

Waters Acquity I-class UPLC系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司），Q-Exactive^TM Orbitrap HRMS系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），臺(tái)式離心機(jī)（ST8R型，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），超聲波清洗器（SK250HP型，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司），萬(wàn)分之一天平（XPE204型，瑞士Mettler-Toledo公司），甲酸（色譜級(jí)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），乙腈、甲醇（色譜級(jí)，德國(guó)默克公司），吳茱萸、生姜、人參、大棗，均購(gòu)于北京同仁堂煙臺(tái)分店。

2 方 法

2.1 供試品溶液制備

將4味藥材（吳茱萸-生姜-人參-大棗，質(zhì)量比1∶2∶1∶1）的粉末放入具塞錐形瓶中，加入10倍體積的75%甲醇，在室溫下超聲（240 W，25 Hz）30 min，離心（13 000 r/min，10 min），上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2 色譜及質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件 采用Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動(dòng)相是體積分?jǐn)?shù)為0.05%的甲酸水溶液（A相），乙腈∶甲醇（4∶1）（B相），流速0.4 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量2 μL，梯度洗脫條件：0～2 min，4% B;2～8 min，4%→10% B;8～12 min，10%→20% B;12～18 min，20%→30% B;18～25 min，30% B→50% B;25～32 min，50% B→70% B;30～35 min，70% B→90% B;35～38 min，90% B。

2.2.2 質(zhì)譜條件 采用加熱型電噴霧離子源（HESI），掃描方式為Full MS/dd-MS²（Top 5），正負(fù)離子模式分別進(jìn)行，分辨率為70 000 FWHM（Full MS）、17 500 FWHM（dd-MS²），掃描范圍80～1200 m/z，噴霧電壓+3.8 /-2.8 kV，鞘氣流速35 arbs，輔助氣流速10 arbs，毛細(xì)管溫度325 ℃，離子源溫度350 ℃，歸一化碰撞能量：20、40、60 eV。

2.3 數(shù)據(jù)分析

2.3.1 分子網(wǎng)絡(luò) 將采集到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)先進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換，隨后臺(tái)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理后上傳至GPNS數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)。將處理后的結(jié)果上傳至Cytoscape軟件上進(jìn)行可視化，對(duì)比相關(guān)節(jié)點(diǎn)相似程度，對(duì)其進(jìn)行分類，推測(cè)出與已知化合物結(jié)構(gòu)相似的類似物或其他未知物。

2.3.2 化合物鑒定 將UPLC-Q-Orbitrap HRMS采集的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Compound Discover 3.2軟件進(jìn)行初步分析，定制相應(yīng)的工作流程，結(jié)合mzCloud、mzVault、Chemspider數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行碎片匹配，設(shè)置化合物匹配打分大于80，相對(duì)分子質(zhì)量理論值和實(shí)際值誤差在5×10^-6以內(nèi)為條件，篩選出吳茱萸湯中存在的化合物。

3 結(jié) 果

3.1 吳茱萸湯分子網(wǎng)絡(luò)分析

分子網(wǎng)絡(luò)可以依據(jù)化合物的二級(jí)質(zhì)譜，將同類化合物聚集成簇，從而將吳茱萸湯中的成分類別清晰展現(xiàn)。因此，本研究首先按照“2.2”項(xiàng)下的色譜和質(zhì)譜條件對(duì)吳茱萸湯提取物進(jìn)行分析，采集其在正、負(fù)離子模式下的基峰色譜圖（圖1）。

將采集到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入GPNS平臺(tái)，再經(jīng)Cytoscape軟件處理，得到其分子網(wǎng)絡(luò)（圖2）。其中，每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表1個(gè)化合物，不同顏色節(jié)點(diǎn)分別代表不同化合物類別，灰色代表未知化合物，節(jié)點(diǎn)之間連線表示2個(gè)化合物具有相似的碎片離子，距離越近代表碎片離子相似性越高，同一類化合物分子會(huì)在一個(gè)分子網(wǎng)絡(luò)中聚集成簇^［10］。最后對(duì)每個(gè)節(jié)點(diǎn)的保留時(shí)間、精確相對(duì)分子質(zhì)量以及二級(jí)碎片進(jìn)行分析，確定了六類化合物，包括糖類、萜類、生物堿類、黃酮類、有機(jī)酸類和苯酚類。

正離子模式下主要得到萜類化合物簇，從中解析了一系列萜類化合物。以m/z 605.439 2、785.503 5、471.201 2三個(gè)化合物為例，通過(guò)對(duì)比其精確相對(duì)分子質(zhì)量和保留時(shí)間，以及吳茱萸湯質(zhì)譜分析提取到的化合物的二級(jí)碎片信息，推斷m/z 605.439 2為人參皂苷Rk2， m/z 785.503 5為人參皂苷Rg3，m/z 471.201 2為檸檬苦素。其中人參皂苷Rk2與人參皂苷Rg3的母核結(jié)構(gòu)均為人參三醇，僅僅在側(cè)鏈以及與苷元相連的糖上有細(xì)小差別，因此二者在分子網(wǎng)絡(luò)中的位置十分接近;而檸檬苦素屬于三萜衍生物，在結(jié)構(gòu)上與前兩者差別較大，被聚集到相距較遠(yuǎn)的萜類簇中。由此可知，分子網(wǎng)絡(luò)對(duì)于識(shí)別同類化合物在結(jié)構(gòu)上的差異具有高靈敏度的特點(diǎn)。

負(fù)離子模式下主要得到糖類化合物簇，從中解析了一系列糖類化合物。以m/z 341.096 0、281.095 0、341.116 2三個(gè)化合物為例，結(jié)合保留時(shí)間與質(zhì)譜數(shù)據(jù)，推斷其分別為海藻糖、木二塘、纖維二糖。對(duì)它們的結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)其均為兩個(gè)單糖分子組成的二糖，結(jié)構(gòu)相似，因此它們?cè)诜肿泳W(wǎng)絡(luò)中的位置十分接近。此外，黃酮類化合物在分子網(wǎng)絡(luò)中也聚集成簇，簇中心的m/z 609.189 3被推斷為新橙皮苷，含有C6-C3-C6的基本結(jié)構(gòu)。

3.2 化合物鑒定

在分子網(wǎng)絡(luò)的分類結(jié)果指導(dǎo)下，進(jìn)一步通過(guò)Compound Discover 3.2對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，最終從吳茱萸湯中鑒定出共計(jì)100個(gè)化合物∶黃酮類33個(gè)、生物堿類22個(gè)、萜類9個(gè)、有機(jī)酸類21個(gè)、糖類6個(gè)、苯丙素類4個(gè)、苯酚類3個(gè)、苷類2個(gè)，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.3 化合物裂解規(guī)律分析

3.3.1 黃酮類化合物裂解途徑分析 結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜圖，共鑒別出黃酮類化合物33個(gè)，以生姜的主要活性成分6-姜酚（圖3）和四味藥材中的共有成分蘆丁（圖4）兩個(gè)化合物為例，對(duì)其裂解途徑進(jìn)行分析。

6-姜酚的分子式為C₁₇H₂₆O₄，正離子模式下，得到m/z 295.168 5的準(zhǔn)分子離子［C₁₇H₂₆O₄］⁺，二級(jí)質(zhì)譜中的碎片離子主要有m/z 179.069 8，m/z "177.090 6，m/z 145.064 6，m/z 137.059 5。結(jié)合文獻(xiàn)^［11］，推測(cè)6-姜酚有三種裂解方式：第一種，碰撞誘導(dǎo)解離，失去一個(gè)—CH₃和一個(gè)—C₈H₁₅O₂形成m/z 137.059 5的碎片離子［C₈H₉O₂］⁺;第二種，失去一個(gè)—C₇H₁₆O形成m/z 179.069 8的碎片離子［C₁₀H₁₁O₃］⁺;第三種，先失去一個(gè)—C₆H₁₄O₂形成m/z 177.090 6的碎片離子［C₁₁H₁₃O₂］⁺，隨后失去一個(gè)—CH₃O形成m/z 145.064 6的碎片離子［C₁₀H₉O］⁺，裂解過(guò)程見(jiàn)圖3。

蘆丁的分子式為C₂₇H₃₀O₁₆，負(fù)離子模式下，得到m/z 609.153 1的準(zhǔn)分子離子［C₂₇H₂₉O₁₆］^-，在二級(jí)質(zhì)譜中的碎片離子主要有m/z 301.034 2，m/z 151.002 6。結(jié)合一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜與文獻(xiàn)^［12-13］，推測(cè)蘆丁經(jīng)過(guò)碰撞誘導(dǎo)解離，失去一個(gè)—C₁₂H₂₀O₉形成m/z 301.034 2的碎片離子［C₁₅H₉O₇］^-。隨后通過(guò)逆狄爾斯-阿爾德裂解，失去一個(gè)—C₈H₅O₃形成m/z 151.002 6的特征碎片［C₇H₃O₄］^-，裂解途徑見(jiàn)圖4。

3.3.2 生物堿類化合物裂解途徑分析 結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜圖，共鑒別出生物堿類化合物22個(gè)，以吳茱萸的主要活性成分吳茱萸堿（圖5）為例，對(duì)其裂解途徑進(jìn)行分析。

吳茱萸堿的分子式為C₁₉H₁₇N₃O，正離子模式下，得到m/z 304.146 9的準(zhǔn)分子離子［C₁₉H₁₈N₃O］⁺。二級(jí)質(zhì)譜中的離子碎片主要有m/z" 171.091 5，m/z 161.070 7，m/z 144.080 8，m/z 134.059 9，推測(cè)吳茱萸堿有兩種裂解方式：第一種，在碰撞誘導(dǎo)解離后被裂解為兩部分，形成m/z 134.059 9的［C₈H₈NO］⁺和m/z 171.091 5的［C₁₁H₁₁N₂］⁺的產(chǎn)物離子;第二種，斷裂后形成m/z 161.070 7的［C₉H₉N₂O］⁺和m/z 144.080 8的［C₁₀H₁₀N］⁺的產(chǎn)物離子，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致^［14-16］，裂解過(guò)程見(jiàn)圖5。

3.3.3 萜類化合物裂解途徑分析 結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜圖，共鑒定出萜類化合物9個(gè)，在此以人參中的代表成分人參皂苷Rg2（圖6）為例，對(duì)其裂解途徑進(jìn)行分析。

人參皂苷Rg2屬于原人參三醇型人參皂苷，分子式為C₄₂H₇₂O₁₃，在負(fù)離子模式下，得到m/z783.494 9的準(zhǔn)分子離子［C₄₂H₇₁O₁₃］^-。在二級(jí)質(zhì)譜中的碎片離子主要有m/z 637.431 5，m/z 475.381 0。結(jié)合文獻(xiàn)^［17-18］，推測(cè)人參皂苷Rg2裂解方式為—C₆H₁₀O₄、—C₆H₁₀O₅的葡萄糖殘基分步中性丟失，分別生成m/z "637.431 5［C₃₆H₆₁O₉］^-和m/z 475.381 9的特征碎片［C₃₀H₅₁O₄］^-。具體裂解過(guò)程見(jiàn)圖6。

4 討 論

本研究在優(yōu)化色譜條件時(shí)，分類考察了三種有機(jī)相種類：甲醇、乙腈、乙腈∶甲醇（4∶1），最終發(fā)現(xiàn)有機(jī)相為乙腈∶甲醇（4∶1）時(shí)的色譜峰形與出峰時(shí)間較好;此外，發(fā)現(xiàn)在基峰色譜圖中2～8 min時(shí)間段內(nèi)出峰密集，因此需要適當(dāng)?shù)胤啪徧荻鹊淖兓?最后，還在流動(dòng)相中加入體積分?jǐn)?shù)為0.05%的甲酸溶液改善峰形。在優(yōu)化質(zhì)譜條件時(shí)，考察了歸一化碰撞能量，文獻(xiàn)中常用15、30、45 eV，但在這個(gè)能量下，吳茱萸湯成分的二級(jí)質(zhì)譜碎片并不豐富，鑒定出的化合物種類也較少，因此，將其適當(dāng)加大到20、40、60 eV，成功地鑒定出更多種類的化合物。

由于糖類化合物結(jié)構(gòu)相似，難以分辨，而分子網(wǎng)絡(luò)可以根據(jù)結(jié)構(gòu)的相似性將化合物聚集成簇，本研究利用分子網(wǎng)絡(luò)首次發(fā)現(xiàn)吳茱萸湯的分子網(wǎng)絡(luò)中集聚了大量糖類化合物，對(duì)吳茱萸湯中糖類化合物的分析具有指導(dǎo)意義。此外，該技術(shù)對(duì)吳茱萸湯中的生物堿類、黃酮類、萜類、苯酚類等化合物信息的收集也比較全面。

5 小 結(jié)

采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)結(jié)合分子網(wǎng)絡(luò)，對(duì)吳茱萸湯的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)分析，成功鑒定出該方中的100個(gè)化合物組分，其中包括：黃酮類33個(gè)、生物堿類22個(gè)、有機(jī)酸類21個(gè)、萜類9個(gè)、糖類6個(gè)、苯丙素類4個(gè)、苯酚類3個(gè)和苷類2個(gè)，為闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了依據(jù)。

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Analysis of Chemical Constituents of Wu-Zhu-Yu Decoction by UPLC-Q-Orbitrap HRMS Method Combined with Molecular Network

CHI Chenglin， LI Caihong， LI Wenjing， LI Zongchao， LIU Rongxia

（School of Pharmacy， Key Laboratory of Molecular Pharmacology and Drug Evaluation（Yantai University）， Ministry of Education， Collaborative Innovation Center of Advanced Drug Delivery System and Biotech Drugs in Universities of Shandong， Yantai University， Yantai 264005， China）

Abstract：The ultra performance liquid chromatography-quadrupole-electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry （UPLC-Q-Orbitrap HRMS） technique combined with molecular network is used for the comprehensive and rapid analysis and identification of the chemical components in Wu-Zhu-Yu decoction. Waters Acquity UPLC HSS T3 column （150 mm×2.1 mm， 1.8 μm） is performed for chromatographic separation. Heated electrospray ionization source （HESI） is applied for data acquisition in positive and negative ion modes. The acquired mass spectrometry data are imported into the GNPS platform to generate a molecular network. Meanwhile the data are imported into Compound Discover 3.2 software for further compound identification. In this research， the components of Wu-Zhu-Yu decoction are quickly classified and a total of 100 compounds are finally identified in Wu-Zhu-Yu decoction， including flavonoids， alkaloids， organic acids， terpenoids， sugars， phenylpropanoids， phenols， and glycosides. In this study， molecular network combined with HRMS technique is utilized for the rapid classification and characterization of the chemical components of Wu-Zhu-Yu decoction， which is valuable for the characterization of complex systems of Traditional Chinese Medicine.

Keywords： Wu-Zhu-Yu decoction; high-resolution mass spectrometry; molecular network; component characterization

（責(zé)任編輯 周雪瑩）