摘要：為了研究雙貝糖漿的抗炎物質基礎，利用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS識別鑒定雙貝糖漿與組方君藥板藍根的主要化學成分及入血成分。UHPLC-Q-Orbitrap HRMS結果顯示，板藍根提取物中含71個主要的化學成分、其中有46個成分可入血，以上化學成分在雙貝糖漿中被檢測到66個、其中42個成分可入血。進一步通過網(wǎng)絡藥理學探討其君藥板藍根的抗炎活性成分及作用機制，通過Griess法結合MTT法驗證雙貝糖漿和板藍根二者共同入血成分的抗炎活性。網(wǎng)絡藥理學分析結果表明板藍根抗炎的關鍵化學成分有金合歡素、異牡荊素、半齒澤蘭素等。以LPS誘導RAW 264.7細胞建立體外炎癥模型，5-羥甲基糠醛、胞苷、異牡荊素、丁香酸在100 μmol/L時，能夠顯著抑制炎癥介質NO的釋放。在大鼠灌胃雙貝糖漿與板藍根提取物的血清樣品中均能夠檢測到異牡荊素，抗炎活性實驗結果表明，其對炎癥介質NO的抑制作用最強，為雙貝糖漿及其君藥板藍根的關鍵抗炎活性成分。

關鍵詞：雙貝糖漿;板藍根;UHPLC-Q-Orbitrap HRMS;入血成分;網(wǎng)絡藥理學;抗炎作用

中圖分類號：R917;R96

文獻標志碼：A

雙貝糖漿（原名消炎靈糖漿）為煙臺市中醫(yī)醫(yī)院臨床使用幾十年的協(xié)定處方，因安全有效，知名度高收載于煙臺市制劑規(guī)范第一版，為煙臺市中醫(yī)醫(yī)院傳統(tǒng)、特色醫(yī)院制劑^［1］。它是由板藍根、金銀花、黃芩、甘草等9味中藥組成的復方制劑，主要用于治療風熱感冒，證見咽候腫痛、咳嗽等。雙貝糖漿的臨床應用歷史悠久，療效確切，但是其藥效物質基礎并未完全闡明，對其有效成分的研究甚少，僅有文獻報道利用高效液相色譜法可測定不同批次雙貝糖漿中黃芩苷的含量^［2］。板藍根為十字花科植物菘藍Isatis indigotica Fort.的干燥根，性寒、味苦，具有抗菌^［3］、抗腫瘤^［4］、抗內毒素^［5］、抗炎^［6］及免疫調節(jié)^［7］等多種藥理作用，板藍根清熱解毒，涼血利咽，為雙貝糖漿復方中的君藥。

雙貝糖漿的主要化學成分與入血成分未曾見報道，本研究基于超高效液相質譜與雜化四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜聯(lián)用（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）技術對雙貝糖漿與其君藥板藍根的主要化學成分及入血成分進行分析，利用網(wǎng)絡藥理學方法^［8-9］研究板藍根的抗炎活性成分及作用機制，并通過Griess法結合MTT法驗證雙貝糖漿和板藍根二者共同的入血成分的抗炎活性。

1 材 料

雙貝糖漿、板藍根由煙臺市中醫(yī)醫(yī)院提供。小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7（ATCC TIB-71）購自中科院上海細胞庫，RPMI 1640培養(yǎng)基購自Invitrogen，LPS和DMSO購自Sigma-Aldrich， Inc （St. Louis， MO， USA）。3111型CO₂培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠），酶標儀（北京普朗新技術有限公司）。超高效液相色譜與雜化四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜聯(lián)用儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），5810R臺式高速大容量冷凍離心機（Eppendorf公司），水為娃哈哈純凈水，甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，乙酸乙酯為分析純。

SPF級SD雄性大鼠，體質量160～200 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（魯）20190003。實驗前在12 h晝夜循環(huán)的動物房內適應性喂養(yǎng)7天，自由獲得飼料和飲用水。

2 方 法

2.1 板藍根水提取物的制備

稱取板藍根粉末，加8倍量水煎煮1 h，放置至室溫，過濾，殘渣加6倍量水煎煮40 min，放置至室溫，過濾，合并以上濾液，濃縮，干燥，制得板藍根干燥粉末。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 將雙貝糖漿稀釋一倍，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，得到雙貝糖漿供試品溶液，用于定性分析。精密稱取0.054 g板藍根干燥粉末，置于5 mL容量瓶，超聲60 min，放置至室溫，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，上清通過0.45 μm微孔濾膜濾過，得板藍根供試品溶液。

2.2.2 灌胃溶液的制備 精確稱取適量的板藍根干燥粉末，加適量水，超聲30 min使其溶解，配置成濃度約為0.135 g/mL板藍根水提取物溶液（即每1 mL含生藥0.41 g）。

2.3 動物分組給藥與血清樣品采集

2.3.1 動物分組給藥 SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為空白組、雙貝糖漿組及板藍根給藥組，每組6只。實驗前禁食不禁水12 h，給藥組灌胃給予3倍量板藍根水提取物溶液及雙貝糖漿1 mL/100 g，空白組給予等量生理鹽水。在給藥后0.5、1、2、4、6、8 h，采用眼眶取血的方式各取250 μL于肝素管中，4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，分離血漿，取上清液，備用。本研究動物實驗經(jīng)過煙臺大學動物倫理委員會審查批準。

2.3.2 血清樣品處理 200 μL血清加入800 μL甲醇沉淀蛋白，渦旋混勻1 min后，4 ℃、12"" 000 r·min^-1離心10 min，取上清液于40 ℃下氮氣吹干，加入200 μL甲醇復溶，渦旋1 min后，4 ℃、12 000 r·min^-1離心10 min，取上清液進樣。

2.4 UHPLC-Q-Orbitrap HRMS檢測條件

2.4.1 色譜條件 Agilent TC-C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫40 ℃，流動相0.1%甲酸水溶液（A）、0.1%甲酸乙腈溶液（B），流速0.4 mL/min，進樣量3 μL，梯度洗脫0～4 min，2%～10%B;4～10 min，10%～15%B;10～14 min，15%～24%B;14～16 min，24%～30%B;16～25 min，30%～45%B;25～34 min，45%～100%B;34～41 min，100%～2%B;41～43 min，2%B。

2.4.2 質譜條件 ESI電離源，正、負離子模式掃描，噴霧電壓+3.5 kV/-2.5 kV，掃描范圍100～1500 m/z，毛細管溫度263 ℃，鞘氣流速50 arbs，輔助氣流速13 arbs，離子源溫度425 ℃。

2.5 板藍根活性成分及靶點篩選

經(jīng)中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP）檢索板藍根的活性成分信息。以口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18為條件，篩選板藍根中主要的有效成分。進一步通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取與活性成分相對應的蛋白靶點，去除重復項，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫規(guī)范蛋白靶點信息，獲得對應的基因名。

2.6 炎癥相關靶點的篩選

運用GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索炎癥相關基因，以“inflammation”為關鍵詞進行檢索，得到炎癥相關基因。將收集到的活性成分預測基因與炎癥基因取對應的交集，繪制韋恩圖，得到共同靶基因，即為板藍根潛在的抗炎靶點基因。

2.7 構建蛋白質相互作用（PPI）網(wǎng)絡分析

將交集靶點輸入到String數(shù)據(jù)庫中進行蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網(wǎng)絡分析，將結果導入Cytoscape 3.7.1中構建蛋白質相互作用網(wǎng)絡圖，并進行拓撲分析，獲取板藍根抗炎的關鍵靶蛋白。

2.8 “板藍根活性成分-預測靶點”網(wǎng)絡的構建

將板藍根的活性成分及預測靶點上傳至Cytoscape 3.7.1軟件中構建“活性成分-靶點”網(wǎng)絡圖，以探討板藍根的藥理作用機制。節(jié)點代表板藍根有效活性成分和作用靶點，邊分別代表活性成分與靶點之間的相互關系。

2.9 KEGG信號通路與GO生物過程富集分析

將交集蛋白導入Metascape數(shù)據(jù)庫進行KEGG信號通路富集分析和GO生物過程富集分析，設置Plt;0.05進行篩選，得到KEGG信號通路氣泡圖和GO富集柱狀圖，并構建“活性成分-核心靶點-通路”網(wǎng)絡圖。

2.10 噻唑藍（MTT）比色法檢測細胞毒性

采用MTT法檢測細胞活力，評價細胞毒性。RAW 264.7細胞以1×10⁶個/mL的細胞密度接種于96孔板中（200 μL/孔）。培養(yǎng)1 h，待細胞貼壁后加入不同的單體化合物，設置空白組、模型組（加入1 μg/mL的LPS）、給藥組（終濃度100 μmol/L），孵育24 h之后，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)孵育4 h。棄掉上清液，每孔加入150 μL DMSO，以630 nm為參比波長，570 nm為檢測波長測定吸光度。

2.11 Griess法檢測炎癥介質NO水平

RAW 264.7細胞以1×10⁶個/mL接種于96孔板中，每孔200 μL細胞液，于37 ℃，5% CO₂細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。設置空白組、模型組（加入1 μg/mL的LPS）、給藥組（終濃度100 μmol/L），孵育24 h，吸取100 μL上清液，加入預先混合均勻的Griess試劑（100 μL/孔），振搖10 min，540 nm處測吸光度，計算不同化合物對炎癥介質NO的抑制率。

3 實驗結果

3.1 體外化學成分鑒定

雙貝糖漿與板藍根正、負離子模式下的總離子流圖如圖1所示?；谖墨I調研并運用Xcalibur 4.0軟件對總離子流上的峰進行精確質量數(shù)識別。雙貝糖漿中共鑒定出66個化學成分，包括31個生物堿類（25個吲哚類、4個喹唑酮類、2個其他類生物堿），13個有機酸類，7個氨基酸類，5個核苷類，4個黃酮類，6個其他類化合物。板藍根水提取物中共鑒定出71個化學成分，包括32個生物堿類（26個吲哚類、4個喹唑酮類、2個其他類生物堿），16個有機酸類，7個氨基酸類，5個核苷類，4個黃酮類，7個其他類化合物。詳見表1。

3.2 體內入血成分鑒定

基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS分析技術，對雙貝糖漿和板藍根水提取物灌胃大鼠后的含藥血清與空白血清進行成分辨識，并對比分析雙貝糖漿和板藍根水提取物樣品成分，根據(jù)色譜峰保留時間及質譜裂解規(guī)律，結合文獻相關信息，推斷出雙貝糖漿血清中含有42種入血成分，板藍根水提取物血清中含有46種入血成分。通過比較兩組含藥血清發(fā)現(xiàn)，8種化學成分僅存在于板藍根血清樣品，4種化學成分僅存在于雙貝糖漿血清樣品，38種為共同的入血成分，詳見表2。

3.3 君藥板藍根的網(wǎng)絡藥理學研究

3.3.1 活性成分及靶點篩選 運用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索獲得板藍根中含有169個化學成分，通過OB≥30%，DL≥0.18進行篩選，得到35個活性成分（表3），包括12個生物堿類、9個黃酮類、2個核苷類、1個有機酸類、11個其他類化合物。檢索活性成分所對應的蛋白靶點，共得到67個靶標基因。

3.3.2 疾病相關靶點篩選 運用篩選的活性成分靶點與疾病靶點進行對照，得到潛在抗炎靶點基因，檢索的67個活性成分靶點與1363個炎癥靶點取交集，得到33個板藍根發(fā)揮抗炎作用的潛在靶點。

3.3.3 PPI網(wǎng)絡分析 取交集靶點上傳至String數(shù)據(jù)庫，獲得PPI網(wǎng)絡圖，運用Cytoscape 3.7.1軟件進行分析，該網(wǎng)絡圖包含節(jié)點30個，邊151條。根據(jù)String數(shù)據(jù)庫中度值（Degree）的大小，對節(jié)點及邊的大小與顏色進行設置，度值越大，節(jié)點越大，顏色越深，表示該點在PPI網(wǎng)絡中起著關鍵作用;邊越粗，表示蛋白質之間的相互作用越大。由圖3所見，TNF、TP53、CASP3、PTGS2、NOS3、MAPK14等靶點在該PPI網(wǎng)絡中位于核心位置，提示在抗炎作用中起關鍵調控作用。

3.3.4 “活性成分-靶點”網(wǎng)絡構建 運用Cytoscape 3.7.1軟件構建“活性成分-靶點”網(wǎng)絡圖，如圖4所示，該網(wǎng)絡圖包含103個節(jié)點和301條邊，體現(xiàn)了板藍根多成分、多靶點的作用機制。

3.3.5 GO分析與KEGG信號通路分析 GO分析（圖5）表明，板藍根參與的生物學過程主要有細胞對氧水平的反應、細胞對氮化合物的反應和凋亡信號通路等過程，細胞組成有內吞囊泡、細胞器外膜和受體復合體等，抗炎靶點功能主要有泛素蛋白連接酶結合、蛋白酶結合和蛋白激酶活性等。

KEGG通路分析結果（圖6）顯示，板藍根抗炎靶點涉及多條與炎癥密切相關的信號通路，包含癌癥信號通路，雌激素信號通路，甲狀腺激素信號通路和神經(jīng)活性配體-受體相互作用等。

3.3.6 “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡的構建 如圖7所示，由于活性成分BLG11，BLG14，BLG15，BLG20，BLG24，BLG26，BLG33和BLG35與炎癥相關的靶點沒有相互作用，故不在圖中顯示。該網(wǎng)絡中有73個節(jié)點，202條邊，根據(jù)度值的大小對活性成分，關鍵靶點與信號通路進行設置，度值越大，靶點顏色越深，該點在該網(wǎng)絡中起著關鍵作用;節(jié)點越大，該成分為主要活性成分，或該通路為主要通路。結果顯示，板藍根的主要活性成分為金合歡素、澤蘭黃素、異牡荊素、半齒澤蘭素等，作用靶點主要為PTGS2，TNF，NOS2，MAPK14等，符合中藥多成分，多靶點，多通路的作用特點。

3.4 主要化學成分對細胞活力的影響

根據(jù)網(wǎng)絡藥理學及UHPLC-Q-Orbitrap HRMS分析結果，選取了11個雙貝糖漿中可入血的主要化學成分，通過MTT法初步評價了它們對RAW 264.7巨噬細胞增殖的影響。如圖8所示，實驗結果表明，鳥苷、蒙花苷、香草乙酮、半齒澤蘭素和色胺酮5個單體化合物在終濃度100 μmol/L時有輕微的細胞毒性。5-羥甲基糠醛、尿苷、鄰氨基苯甲醛、胞苷、異牡荊素、丁香酸在100 μmol/L時，對RAW 264.7細胞正常增殖無影響。

3.5 雙貝糖漿主要入血活性成分對LPS誘導巨噬細胞釋放炎癥介質NO的抑制活性

如圖9所示，5-羥甲基糠醛、胞苷、異牡荊素、丁香酸在100 μmol/L時，能夠顯著抑制炎癥介質NO的釋放。

4 討 論

雙貝糖漿由板藍根等9味中藥組成，化學成分復雜多樣，臨床發(fā)揮藥效的物質基礎不清楚。UHPLC-Q-Orbitrap HRMS具有高分辨，高靈敏度和分析速度快等特點^［10］，在中藥復雜體系物質基礎研究中具有顯著優(yōu)勢^［11］。本研究運用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技術鑒定雙貝糖漿與君藥板藍根的化學成分，以期發(fā)現(xiàn)能夠入血的重要成分，實驗結果表明板藍根提取物含71個化學成分、46個入血成分，以上成分在雙貝糖漿中僅檢測出66個、42個成分可入血。其中，38個共同的入血成分可能是入血發(fā)揮藥效的關鍵成分。

黃酮類成分具有抗炎、抗氧化等一系列藥理活性，異牡荊素已被證明具有多種生物學特性，在體內外均能有效地保護LPS誘導的損傷、氧化應激和炎癥^［12］。本研究結果表明，入血成分5-羥甲基糠醛、胞苷、異牡荊素、丁香酸在100 μmol/L時，不影響細胞的正常增殖，能夠顯著抑制炎癥介質NO的釋放，網(wǎng)絡藥理學預測的關鍵成分異牡荊素對炎癥介質NO的抑制效果最強，為雙貝糖漿發(fā)揮抗炎作用的主要活性成分，可為雙貝糖漿后續(xù)抗炎機制的深入研究提供依據(jù)。本研究對提升雙貝糖漿的質量控制標準、完善其藥效機制研究及指導其進一步的臨床應用具有一定的意義。

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Constituents Absorbed into Blood and Anti-inflammatory Active Constituents of Shuang Bei Tang Jiang and Isatidis Radix

XU Yaoyao¹， JIN Xin²， YU Xiangtao²， GAO Yinhe¹， ZHAO Feng¹

（1. School of Pharmacy， Key Laboratory of Molecular Pharmacology and Drug Evaluation of Ministry of Education （Yantai University）， Collaborative Innovation Center for Novel Preparations and Biotechnology Drugs of Shandong Province， Yantai University， Yantai 264005， China; 2. Yantai Hospital of Traditional Chinese Medicine， Yantai 264000， China）

Abstract：In order to study the anti-inflammatory substance basis of “Shuang Bei Tang Jiang”， UHPLC-Q-Orbitrap HRMS is used to identify the chemical components and constituents can be absorbed into blood of Shuang Bei Tang Jiang and Isatidis Radix. The results of UHPLC-Q-Orbitrap HRMS show that the extract of Isatidis Radix contains 71 main chemical components， 46 among of them could enter the blood， while 66 of the above chemical components are detected in Shuang Bei Tang Jiang， 42 of them could enter the blood. Further， the anti-inflammatory active ingredients and the mechanism of action of its main drug Isatidis Radix are discussed through network pharmacology， and the anti-inflammatory activity of the main active components are verified by Griess method combined with MTT method. The results of network pharmacologic analysis showed that the key anti-inflammatory components are acacia， isovitexin and eupatorin. 5-hydroxymethylfurfural， cytidine， isovitexin and syringic acid significantly inhibite NO release induced by LPS at 100 μmol/L in RAW 264.7 cells. Isovitexin can be detected in serum samples of Shuang Bei Tang Jiang and Isatidis Radix. The results of anti-inflammatory activity experiment show that isovitexin has the strongest inhibitory effect on NO production， and maybe the key anti-inflammatory active component of Shuang Bei Tang Jiang and Isatidis Radix.

Keywords：Shuang Bei Tang Jiang; Isatidis Radix; UHPLC-Q-Orbitrap HRMS; constituents absorbed into blood; network pharmacology; anti-inflammatory effect

（責任編輯 周雪瑩）