羅維宇 宿慶連 曾瑞珍 袁赟 魏倩 張志勝

關(guān)鍵詞：蘭花；誘變育種；突變體；品種；研究進展

蘭花是蘭科（Orchidaceae）的總稱，具有很高的觀賞價值、藥用價值、食用價值和或文化價值，深受世界各國人們的喜愛。迄今，已鑒定出蘭科植物27801種，899屬[1]，在英國皇家學(xué)會登錄的集體雜種超過15萬個。在我國，傳統(tǒng)意義上的蘭花是指蘭科蘭屬（Cymbidium）植物，特別是其中的地生種類，也就是今天的國蘭。蘭花是中國傳統(tǒng)十大名花之一，是世界著名的觀賞植物，也是當(dāng)今生物學(xué)領(lǐng)域研究生命和進化的理想模式植物。

新品種選育是蘭花產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的基礎(chǔ)。蘭花新品種選育的主要方法有引種馴化、選擇育種、雜交育種、誘變育種和倍性育種等。誘變育種是指通過人為控制化學(xué)、物理因素誘導(dǎo)植物，使其發(fā)生遺傳變異，從可遺傳變異性狀中挑選出有利目標(biāo)性狀，最終培育出新品種或種質(zhì)資源的方法[2]，具有育種年限短、突變方向不確定、突變范圍廣、可以產(chǎn)生特殊變異等特點。自1979年KOZLOWSKA-KALISZ[3]使用γ射線輻照蘭花以來，蘭花誘變育種取得了巨大進步，獲得了一批葉色葉型、花色花型改變以及抗性提升等特性的突變體。本文對蘭花誘變育種研究進行綜述，旨在明確蘭花誘變育種現(xiàn)狀和影響蘭花誘變育種效果的因素，總結(jié)蘭花誘變機理，找出進一步提高蘭花誘變育種效率和效果的方法，為更好地利用誘變育種技術(shù)培育蘭花新品種，深入闡明蘭花誘變和進化機理提供參考。

1蘭花誘變方法

蘭花誘變方法主要包括物理誘變、化學(xué)誘變、空間誘變，這3類誘變方法在蘭花育種中均有研究報道，其中物理誘變的研究報道最多，成效最大。

1.1物理誘變

物理誘變育種是指利用物理因素誘導(dǎo)動植物的遺傳特性發(fā)生變異，再從變異群體中選擇符合人們某種要求的單株或個體，進而培育成新的品種或種質(zhì)的育種方法[4]。迄今，至少已在蘭屬、蝴蝶蘭屬、石斛蘭屬等13個屬44種蘭花中開展了物理誘變育種研究，獲得突變體716個，培育出小蘭嶼蝴蝶蘭飛蘭等蘭花新品種12個（表1），其中5個來自突變體庫（TheMutantVarietiesDatabaseoftheInternationalAtomicEnergyAgency，IAEA）。

用于蘭花輻照的輻照源有γ射線[3，5-66]、重離子束[55，67-74]、快中子[75-76]和紫外線[77]等。60Co-γ射線是最常用的輻照源，近年來，采用重離子束輻照逐漸增多，與γ射線輻射相比，碳重離子輻照的植株突變頻率更高，突變譜更寬[78]。LUAN等[55]分別使用60Co-γ射線和12C6+重離子輻照2種蝴蝶蘭，在60Co-γ射線輻照的2種蝴蝶蘭中均未發(fā)現(xiàn)變異系，而在12C6+重離子（3Gy）輻照的2種樣本中篩選出24個變異系。

除了輻照源外，輻照材料、劑量和劑量率也是影響蘭花輻照效果的重要因素。在蘭花誘變育種中，多數(shù)研究人員將半致死劑量（LD50）作為最佳誘變劑量，采用的誘變材料多為原球莖、類原球莖和根狀莖。不同種、品種、輻照材料的LD50不同，因此在蘭花誘變育種中，確定輻照材料的LD50值十分重要。蘭花根狀莖輻照后，有時不同劑量處理后的材料均能存活，但生長停滯。因此，當(dāng)無法用半致死量對輻射誘變效果進行評估時，有使用半減少劑量（the50%reductiondose，RD50）作為最佳誘變劑量的報道[21，23]。

物理誘變引起蘭花株型、株高、分蘗性，葉數(shù)、葉形、葉色、花序、花數(shù)、花型、花色、花期，抗病性、抗蟲性、組培快繁特性等性狀的變化（表1）。其中葉色突變出現(xiàn)的頻率最高，表明通過物理誘變選育蘭花葉色變異新品種的成功率高。

一般認(rèn)為誘變育種對改變植物個別性狀是有效的，但越來越多的研究結(jié)果表明，輻照能改變蘭花的多個性狀。主要原因是輻照能夠引起染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)變異，導(dǎo)致多個基因的改變，此外一因多效等也會導(dǎo)致多個性狀發(fā)生改變。耿慶芝[69]采用重離子輻照君豪蘭根狀莖，獲得了株型、葉數(shù)、葉色變異等多個突變體，其中葉藝突變體植株生長緩慢、植株矮小、適應(yīng)性差（圖1）。

1.2化學(xué)誘變

化學(xué)誘變是指利用化學(xué)藥劑與遺傳物質(zhì)發(fā)生生物化學(xué)反應(yīng)，引起基因發(fā)生點突變[2]，具有容易操作、劑量易控制、對基因組損傷小、突變率高等特點[79]。迄今，至少已在蘭屬、石斛蘭屬、蝴蝶蘭屬等6個屬13個蘭花種中開展了化學(xué)誘變育種研究。已有結(jié)果表明，化學(xué)誘變可導(dǎo)致蘭花株高、葉數(shù)、葉色、葉寬、抗病性、抗逆性等性狀的改變，至少已獲得葉色改變、矮化、抗病、抗寒等突變體206個，其中葉色改變和矮化突變體是常見的變異類型（表2）。

在蘭花上使用的化學(xué)誘變劑有烷化劑[甲基磺酸乙酯（EMS），硫酸二乙脂（DES）]、呼吸抑制劑[疊氮化鈉（NaN3）]、堿基類似物[5-溴尿嘧啶（5-BU），馬來酰肼（MH）]以及其他誘變劑如亞硫酸鈉（Na2SO3）和咖啡堿等。其中烷化劑是最常用的化學(xué)誘變劑，占65.4%；其次是疊氮化鈉，占19.2%（表2）。不同誘變劑對蘭花的誘變效率不同。李夏[80]使用多種化學(xué)誘變劑對寒蘭原球莖進行誘變處理，結(jié)果表明，誘變效率從高到低的排序為EMS>DES>MH>Na2SO3>咖啡堿>5-BU。陳超等[81]用EMS和NaN3對蝴蝶蘭類原球莖（PLB）進行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EMS的誘變效果比NaN3好。

誘變劑濃度、誘變方法和材料選擇是影響蘭花化學(xué)誘變效率的主要因素。根狀莖、原球莖和類原球莖等中間繁殖體是常用的誘變材料，浸泡法是最常用的處理方法。不同材料和不同誘變劑，其誘變劑量和處理時間不同，誘變效率也不同。對蘭花中間繁殖體，EMS的常用濃度為0.05%～1.00%，NaN3濃度為2.0～8.0mmol/L。EMS能在溶液中和細(xì)胞內(nèi)部水解產(chǎn)生強酸，不僅使溶液中的EMS濃度降低，而且酸性水解產(chǎn)物對細(xì)胞有毒害作用，對處理材料造成生理損傷，降低存活率，從而降低了誘變效率[98]，因此EMS溶液一般用濃度不超過0.1mol/L的磷酸緩沖液（pH7.0）配制，但也有將EMS直接加入液體培養(yǎng)基進行誘變處理，并得到較多突變體的報道[82-83]。

1.3空間誘變

空間誘變育種是指利用返回式衛(wèi)星、宇宙飛船或高空氣球?qū)⑥r(nóng)作物種子帶到太空，利用太空特殊的環(huán)境（空間宇宙射線、微重力、高真空、弱磁場等因素）誘發(fā)植物產(chǎn)生變異，再返回地面選育新品種的技術(shù)[99]，該技術(shù)具有突變譜廣、誘變頻率高和對植株損傷小等特點[100]?？臻g誘變至少已應(yīng)用于石斛蘭屬和蝴蝶蘭屬2個屬4個種中，已獲得8個突變體、選育出4個新品種?？臻g誘變導(dǎo)致金釵石斛矮化、莖變粗、分蘗多；能促進鐵皮石斛生長、提高產(chǎn)量；使蝴蝶蘭花變大、花朵數(shù)變多、觀賞期延長、抗病性抗逆性增強（表3）。石斛種子經(jīng)過空間誘變選出了矮化新品種Uju[51]。陳肖英等[101]利用空間誘變技術(shù)，培育出花大色艷、抗性強和適應(yīng)性好的優(yōu)良蝴蝶蘭新品種航蝴1號。

2蘭花突變體的篩選鑒定

表型鑒定是蘭科植株突變體鑒定中簡單、經(jīng)濟、實用的方法。在組培過程中或田間觀察到有植株與對照植株在株型、葉色、葉型、花色、花形、花期、抗性等方面存在明顯差異時，該植株會被單獨選出，通過分株繁殖、扦插繁殖或組培快繁生產(chǎn)株系，如果變異性狀在株系內(nèi)一致且穩(wěn)定，一般就認(rèn)為該變異植株是突變體。采用分子標(biāo)記對變異植株和對照植株進行分析，如果變異植株和對照植株在DNA水平上存在差異，則進一步證明變異植株是突變體[105]，但是分子鑒定結(jié)果與植株表型性狀的變化之間可能并不存在一一對應(yīng)關(guān)系[6]。

蘭花的營養(yǎng)生長期一般為3～5a。為了提早進行突變體篩選和鑒定，對于肉眼不可見、不穩(wěn)定或不容易鑒定的性狀，開發(fā)出新的育種目標(biāo)性狀突變體篩選和鑒定技術(shù)是十分重要的。在一些蘭花上已建立分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)[106]、試管花誘導(dǎo)技術(shù)體系[107]、莖腐病抗性品種篩選和鑒定技術(shù)[70]等，有的已應(yīng)用于突變體篩選。

3蘭花誘變機理

誘變可以引起蘭花染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)、基因結(jié)構(gòu)和表達的變異，從而導(dǎo)致性狀改變。γ射線輻照能引起染色體數(shù)目改變，形成非整倍體[54]，也能引起核型改變[19]。對葉藝隆昌素葉藝形成的分子機理研究結(jié)果表明，編碼尿卟啉原脫羧酶基因HEME在葉藝隆昌素中表達下調(diào)，而葉綠素生物合成中編碼鎂原卟啉Ⅸ甲基轉(zhuǎn)移酶基因CHLM、谷氨酸-tRNA還原酶基因HEMA和葉綠素降解相關(guān)基因表達上調(diào)，說明色素合成、葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的差異表達可能是導(dǎo)致隆昌素葉藝形成的原因[5，108-109]。KIM等[24]對蘭花黃葉突變體進行RNA測序分析，發(fā)現(xiàn)葉綠素代謝或離子運輸?shù)母淖冇锌赡軐?dǎo)致蘭花葉色變黃。LIM等[50]對石斛紫葉突變體進行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)突變體葉片變紫色與花青素生物合成途徑中生物合成酶基因和MYB2等幾個轉(zhuǎn)錄因子表達增加有關(guān)。卓志勇[110]用IlluminaHiseqX技術(shù)對君豪蘭和重離子輻照誘變形成的線藝君豪蘭葉片、根和莖混樣進行轉(zhuǎn)錄組測序和基因表達分析，篩選出2個與蘭花線藝性狀突變有關(guān)的候選基因，分別為CYP76B10和PSBO。

4展望

蘭花是中國的傳統(tǒng)十大名花之一，中國人賞蘭不僅賞花，而且賞葉。誘變處理可以誘導(dǎo)蘭花產(chǎn)生豐富的遺傳變異，特別是誘導(dǎo)蘭花產(chǎn)生豐富的株型和葉部性狀變異，因此誘變育種非常適合我國蘭花育種工作。隨著我國經(jīng)濟發(fā)展和科技進步，可以進一步提高誘變當(dāng)代突變效率和突變譜的誘變新技術(shù)（重離子輻照、空間誘變等）的不斷出現(xiàn)，蘭花誘變育種技術(shù)有望成為進一步加快我國蘭花育種進程，盡快縮小與國外在蘭花育種上差距的關(guān)鍵技術(shù)之一。

進一步提高誘變育種效率和效果是今后蘭花誘變育種研究的主要任務(wù)，可以主要從以下幾個方面深入系統(tǒng)地開展研究工作。首先是進一步提高誘變效率。篩選高效誘變劑、適宜的誘變材料和方法依然是建立高效誘變育種技術(shù)體系的基礎(chǔ)性工作，在此基礎(chǔ)上，可通過多種誘變技術(shù)的結(jié)合進一步提高誘變效率[64]。其次是建立高效突變體篩選和鑒定技術(shù)體系。隨著基因組測序和功能基因組學(xué)研究的不斷深入，蘭花高密度分子遺傳圖譜的建立和主要育種目標(biāo)性狀關(guān)鍵基因的挖掘不斷取得新進展[111]，在此基礎(chǔ)上，建立高效分子標(biāo)記輔助選擇體系和定向誘導(dǎo)基因組局部突變（TargetingInducedLocalLesionsINGenomes，TILLING）等技術(shù)成為可能，這些技術(shù)在蘭花誘變育種上的應(yīng)用將進一步提高突變體篩選和鑒定效率。再次是建立蘭花快速高效育種技術(shù)。將雜交、誘變和細(xì)胞工程技術(shù)相結(jié)合，建立多種育種技術(shù)相融合的蘭花快速高效育種技術(shù)不僅可以提高蘭花育種效率，而且可以縮短蘭花育種周期，快速培育優(yōu)良蘭花新品種。最后是進一步明確蘭花誘變育種的倍性效應(yīng)。多數(shù)蘭花商業(yè)化品種是多倍體[112-113]，不同倍性蘭花品種誘變效果可能有差異，因此系統(tǒng)開展倍性對蘭花誘變育種效果的影響是非常有必要的。

誘變機理研究對進一步提高蘭花誘變育種效率具有重要的促進作用。大量研究表明，誘變通過引起染色體數(shù)目改變[54]、染色體結(jié)構(gòu)變異[19]、基因結(jié)構(gòu)變異和表達水平變化[108-109]等改變植物性狀。不同誘變劑誘導(dǎo)遺傳物質(zhì)改變的類型、頻率和誘發(fā)植物變異的性狀不完全相同，不同類型遺傳物質(zhì)的改變導(dǎo)致蘭花性狀改變的機理也不同。誘變劑是如何引起遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，從而進一步導(dǎo)致性狀改變的，目前這些機理尚不十分清楚，今后應(yīng)進一步加強這方面的研究。