龐彬彬 夏沁韻 陳 震 邢怡橋

自身免疫性葡萄膜炎是累及葡萄膜、視網(wǎng)膜等多個(gè)部位的眼內(nèi)非感染性炎癥,病因復(fù)雜,?？蓪?dǎo)致嚴(yán)重的視功能損害[1]。目前,皮質(zhì)類固醇和免疫抑制劑是治療葡萄膜炎的主要藥物,但長(zhǎng)期使用可引起局部或全身毒副作用[2]。因此,尋找安全有效的治療藥物是葡萄膜炎研究的重要課題。小膠質(zhì)細(xì)胞是常駐于視網(wǎng)膜和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的免疫細(xì)胞,參與多種神經(jīng)退行性疾病和眼部疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后[3]。研究表明,抑制M1型小膠質(zhì)細(xì)胞活化或調(diào)節(jié)M1/M2型小膠質(zhì)細(xì)胞極化平衡可以緩解自身免疫性葡萄膜炎的發(fā)展[4-5]。雷公藤紅素是來(lái)源于中草藥雷公藤的主要活性天然產(chǎn)物之一,具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗肥胖等多種生物學(xué)功能[6-9]。研究發(fā)現(xiàn),雷公藤紅素可抑制阿爾茨海默病患者小膠質(zhì)細(xì)胞活化,減少炎癥因子產(chǎn)生和神經(jīng)元死亡,延緩患者認(rèn)知衰退;人們推測(cè)雷公藤紅素能通過(guò)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞極化,進(jìn)而減輕葡萄膜炎的進(jìn)一步發(fā)展[10-11]。本研究利用小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)模型,探討雷公藤紅素在EAU小鼠眼組織中的抗炎作用及其對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響,為葡萄膜炎的治療提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

取健康6～8周齡B10.RIII小鼠36只,購(gòu)自Jackson實(shí)驗(yàn)室,飼養(yǎng)于武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF環(huán)境中,明暗循環(huán) 12 h/12 h。動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵守《湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》,并獲得武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)許可[批準(zhǔn)號(hào)：WDRM動(dòng)(福)第20211206號(hào)]。

1.1.2 主要試劑及儀器

光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白161-180 (上海生工生物工程股份有限公司),完全弗氏佐劑(美國(guó)Sigma公司),雷公藤紅素(上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司),抗 GAPDH抗體(武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司),抗誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶-1(Arg1)抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司),抗離子鈣結(jié)合適配器分子-1(Iba1)抗體(美國(guó)Abcam公司),AlexaFluor 488 IgG(美國(guó)Jackson公司),RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑(南京諾唯贊生物科技股份有限公司);CFX熒光定量PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司),酶標(biāo)儀(美國(guó)Perkin Elmer公司),正置熒光顯微鏡 BX51(日本Olympus株式會(huì)社)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

采用隨機(jī)數(shù)字表法將36只小鼠分為正常對(duì)照組、EAU溶劑對(duì)照組、雷公藤紅素干預(yù)組,每組12只。參照文獻(xiàn)[12],將光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白161-180和完全弗氏佐劑充分乳化混合后,注射于EAU溶劑對(duì)照組和雷公藤紅素干預(yù)組小鼠雙側(cè)大腿和尾部皮下,總體積200 μL,每只小鼠注射光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白161-180的量為50 μg。免疫后第7天,在裂隙燈下觀察小鼠眼前節(jié)反應(yīng),確保造模成功。第7-14天,雷公藤紅素干預(yù)組小鼠每天接受0.5 mg·kg-1雷公藤紅素腹腔注射治療,EAU溶劑對(duì)照組小鼠注射同等劑量的無(wú)菌PBS緩沖溶液。

1.2.2 小鼠臨床評(píng)分及組織病理學(xué)評(píng)分

免疫后第14天,每組各取6只小鼠,通過(guò)裂隙燈顯微鏡觀察各組小鼠眼前節(jié)表現(xiàn),并參照Caspi分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行EAU臨床評(píng)分[13]。處死小鼠,取雙側(cè)眼球,用眼球固定液固定24 h,石蠟包埋,沿瞳孔-視神經(jīng)軸收集連續(xù)的4～6 μm切片,并用HE染色,在顯微鏡下根據(jù)Caspi分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分。

1.2.3 免疫熒光染色檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況

將各組小鼠石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)后,用體積分?jǐn)?shù)3%BSA-PBS封閉30 min;加抗 Iba1 抗體(12 000)4 ℃孵育過(guò)夜,PBS 洗滌;二抗 AlexaFluor 488 IgG(1500)室溫孵育2 h,PBS 洗滌;最后,用DAPI 室溫孵育10 min。予以抗熒光淬滅劑封片后在熒光顯微鏡下觀察、記錄各組小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況。

1.2.4 Western blot檢測(cè)iNOS、Arg1蛋白表達(dá)

免疫后第14天,每組各取3只小鼠處死,摘除雙側(cè)眼球。分離小鼠視網(wǎng)膜組織,加入RIPA組織細(xì)胞裂解液,使用超聲粉碎儀冰上粉碎裂解視網(wǎng)膜,離心并收集上清,BCA法檢測(cè)并計(jì)算各組樣品的蛋白濃度。采用100 g·L-1SDS-PAGE進(jìn)行電泳,轉(zhuǎn)膜、封閉處理后,加抗iNOS抗體(11 000)、抗Arg1抗體(11 000)、抗GAPDH抗體(15 000),4 ℃孵育過(guò)夜。第2天,PBST洗滌,HRP二抗室溫敷育1 h,經(jīng)PBST洗滌后,予以ECL顯色成像。應(yīng)用ImageJ軟件分析條帶灰度值,目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.2.5 qRT-PCR檢測(cè)炎癥因子腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6 mRNA表達(dá)

免疫后第14天,每組各取處死3只小鼠,摘除雙側(cè)眼球。在無(wú)酶條件下分離小鼠視網(wǎng)膜組織,采用Trizol提取視網(wǎng)膜總 RNA,將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA ,隨后以cDNA為模板按照如下體系進(jìn)行 qRT-PCR 檢測(cè)。引物序列如下：β-actin上游引物為5’-CATTGCTGACAGGATGCAGAAGG-3’,下游引物為5’-TGCTGGAAGGTGGACAGTGAGG-3’;腫瘤壞死因子(TNF)-α上游引物為5’-GGTGCCTATGTCTCAGCCTCTT-3’,下游引物為5’-GCCATAGAACTGATGAGAGGGAG-3’;白細(xì)胞介素(IL)-1β上游引物為5’-TGGACCTTCCAGGATGAGGACA-3’,下游引物為5’-GTTCATCTCGGAGCCTGTAGTG-3’;IL-6上游引物為5’-TACCACTTCACAAGTCGGAGGC-3’,下游引物為5’-CTGCAAGTGCATCATCGTTGTTC-3’。反應(yīng)體系為每孔20 μL,反應(yīng)條件為：95 ℃、30 s,循環(huán)1次;95 ℃、10 s,60 ℃、30 s,循環(huán)40次;95 ℃、15 s,60 ℃、1 min,95 ℃、15 s,循環(huán)1次。qRT-PCR完成后,按 2-ΔΔCt計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad Prism 9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差分析(ANOVA),兩兩比較采用q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠眼前節(jié)表現(xiàn)及臨床評(píng)分

免疫后第14天,通過(guò)裂隙燈顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),EAU溶劑對(duì)照組小鼠眼前節(jié)可見(jiàn)虹膜血管擴(kuò)張充血明顯、角膜水腫、前房滲出;而雷公藤紅素干預(yù)組小鼠眼前節(jié)炎癥明顯減輕,可見(jiàn)虹膜血管輕度充血(圖1)。各組小鼠臨床評(píng)分,總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=55.50,P<0.05);與正常對(duì)照組相比,EAU溶劑對(duì)照組與雷公藤紅素干預(yù)組小鼠臨床評(píng)分均升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。雷公藤紅素干預(yù)組小鼠臨床評(píng)分低于EAU溶劑對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 免疫后第14天各組小鼠臨床評(píng)分及組織病理學(xué)評(píng)分

2.2 各組小鼠HE染色結(jié)果及組織病理學(xué)評(píng)分

HE染色結(jié)果顯示,免疫后第14天,EAU溶劑對(duì)照組小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的視網(wǎng)膜皺褶和脫離,炎癥細(xì)胞彌漫浸潤(rùn);而雷公藤紅素干預(yù)組小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)破壞輕微,可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2)。各組小鼠組織病理學(xué)評(píng)分總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=75.76,P<0.05)。與正常對(duì)照組相比,EAU溶劑對(duì)照組與雷公藤紅素干預(yù)組小鼠組織病理學(xué)評(píng)分均升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。雷公藤紅素干預(yù)組小鼠組織病理學(xué)評(píng)分低于EAU溶劑對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

A：正常對(duì)照組;B：EAU溶劑對(duì)照組;C：雷公藤紅素干預(yù)組。 圖2 各組小鼠視網(wǎng)膜組織HE染色結(jié)果(×200)

2.3 各組小鼠眼內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況

利用 Iba1進(jìn)行免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),免疫后第14天,EAU溶劑對(duì)照組小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活化增多,細(xì)胞增大變形,散在分布;而雷公藤紅素干預(yù)組小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活化明顯減少,主要分布于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層和外叢狀層。正常對(duì)照組、EAU溶劑對(duì)照組、雷公藤紅素干預(yù)組小鼠眼內(nèi)Iba1+細(xì)胞密度分別為(1.00±0.12)%、(36.07±4.57)%、(1.83±0.36)%,各組Iba1+細(xì)胞數(shù)總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=57.16,P<0.05)。與正常對(duì)照組相比,EAU溶劑對(duì)照組及雷公藤紅素干預(yù)組小鼠眼內(nèi)Iba1+細(xì)胞數(shù)增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05);與EAU溶劑對(duì)照組相比,雷公藤紅素干預(yù)組小鼠眼內(nèi)Iba1+細(xì)胞數(shù)明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

DAPI免疫反應(yīng)細(xì)胞核陽(yáng)性染色為藍(lán)色, Iba1免疫反應(yīng)小膠質(zhì)細(xì)胞陽(yáng)性染色為綠色。GCL：神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層;IPL：內(nèi)叢狀層;INL：內(nèi)核層;OPL：外叢狀層;ONL：外核層。圖3 各組小鼠眼內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況

2.4 各組小鼠視網(wǎng)膜iNOS、Arg1蛋白表達(dá)水平

Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示,免疫后第14天,各組小鼠視網(wǎng)膜 iNOS、Arg1蛋白表達(dá)水平總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=19.54、10.88,均為P<0.05);與正常對(duì)照組相比,EAU溶劑對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜中iNOS、Arg1蛋白表達(dá)水平均升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01);與EAU溶劑對(duì)照組相比,雷公藤紅素干預(yù)組小鼠視網(wǎng)膜中iNOS蛋白表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而Arg1表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)(圖4)。

**P<0.01,ns示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖4 各組小鼠視網(wǎng)膜iNOS、Arg1蛋白表達(dá)水平

2.5 各組小鼠視網(wǎng)膜炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)水平

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,免疫后第14天,各組小鼠視網(wǎng)膜中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.45、9.97、53.44,均為P<0.05)。與正常對(duì)照組相比,EAU溶劑對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05);與EAU溶劑對(duì)照組相比,雷公藤紅素干預(yù)組小鼠視網(wǎng)膜中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量均下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(表2)。

表2 各組小鼠視網(wǎng)膜炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)水平

3 討論

雷公藤紅素于1936年被發(fā)現(xiàn),它是最有可能開(kāi)發(fā)成現(xiàn)代藥物的分子之一[14]。其在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮保護(hù)作用。本研究中,我們每天給予EAU小鼠腹腔注射0.5 mg·kg-1雷公藤紅素進(jìn)行治療。結(jié)果顯示,EAU溶劑對(duì)照組小鼠出現(xiàn)虹膜血管擴(kuò)張充血、角膜水腫、前房滲出等明顯炎癥反應(yīng);HE染色顯示EAU溶劑對(duì)照組小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的視網(wǎng)膜皺褶和脫離,炎癥細(xì)胞彌漫浸潤(rùn)。而雷公藤紅素干預(yù)組小鼠炎癥反應(yīng)及視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)破壞均明顯減輕。這表明雷公藤紅素可減輕EAU小鼠視網(wǎng)膜的炎癥反應(yīng),具有很好的抗炎作用。

在生理?xiàng)l件下,小膠質(zhì)細(xì)胞呈高度分支狀,主要局限于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層和外叢狀層;當(dāng)暴露于病理性刺激環(huán)境時(shí),小膠質(zhì)細(xì)胞迅速增大變形為阿米巴狀,遷移到損傷部位,并引起許多免疫反應(yīng)[15]。Iba1是檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的經(jīng)典標(biāo)志物[16]。我們利用Iba1標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞,結(jié)果顯示,正常小鼠中,小膠質(zhì)細(xì)胞活化幾乎不可見(jiàn),而EAU免疫后小鼠眼內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活化明顯增加,細(xì)胞增大變形,并遷移到視網(wǎng)膜各層及玻璃體內(nèi);而雷公藤紅素干預(yù)后小膠質(zhì)細(xì)胞活化數(shù)量顯著減少且分布主要局限于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層和外叢狀層。這表明雷公藤紅素可抑制EAU小鼠中小膠質(zhì)細(xì)胞活化。小膠質(zhì)細(xì)胞極化分為“經(jīng)典激活”的M1型及“替代激活”的M2型,活化為M1型時(shí)會(huì)促進(jìn)炎癥反應(yīng),導(dǎo)致組織損傷,而活化為M2型時(shí)則參與炎癥消退、免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)等[17]。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞活化主要產(chǎn)生TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS等促炎細(xì)胞因子,而M2型小膠質(zhì)細(xì)胞則主要表達(dá)Arg1、CD206等抗炎細(xì)胞因子[18]。iNOS、Arg1是代表M1、M2型小膠質(zhì)細(xì)胞的經(jīng)典標(biāo)志物[19]。為了進(jìn)一步探究雷公藤紅素對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響,我們用Western blot分別檢測(cè)小鼠視網(wǎng)膜iNOS、 Arg1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示,免疫后第14天,iNOS、Arg1蛋白表達(dá)水平均升高;雷公藤紅素干預(yù)后,iNOS表達(dá)水平降低,而Arg1蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變。同時(shí),qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,雷公藤紅素干預(yù)后,TNF-α、 IL-1β、IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低。這表明雷公藤紅素可抑制M1型小膠質(zhì)細(xì)胞活化及其相關(guān)炎癥因子表達(dá)。

本研究尚存在一些不足,如我們只探究了雷公藤紅素對(duì)EAU小鼠體內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響,而其在體外對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響未曾探究。另外,還需探討梯度濃度雷公藤紅素干預(yù)對(duì)于EAU的治療作用,發(fā)掘安全有效的最低藥物濃度。雖然雷公藤紅素在EAU治療中表現(xiàn)出顯著效果,但由于其水溶性較差等原因,生物利用度有限,這會(huì)限制其在臨床中的應(yīng)用。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,雷公藤紅素可抑制M1型小膠質(zhì)細(xì)胞活化,減少EAU小鼠視網(wǎng)膜炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的產(chǎn)生,減輕炎癥反應(yīng)。其有望成為治療自身免疫性葡萄膜炎的有效手段。