郭 松，于 蓉，董 瑞，李 程，田 梅

（寧夏農林科學院園藝研究所 銀川 750002）

土壤中微生物種群和數量是土壤微生態(tài)環(huán)境的重要組成部分。西瓜根際土壤中的微生態(tài)環(huán)境與枯萎病等土傳病害的抗性機制密切相關。西瓜枯萎病等土傳病害的發(fā)生概率及危害程度受到土壤中微生物種群比例的影響[1-2]。土壤微生物群落中細菌群落結構占比70%以上，其在養(yǎng)分循環(huán)、防控土傳病害等方面發(fā)揮重要作用[3]。西瓜嫁接處理后，砧木和西瓜接穗的互作會影響根系分泌物，使土壤中的微生物組成發(fā)生變化[4-5]。

西瓜嫁接技術比較廣泛地應用到生產中，其對根際土壤微生物數量和群落結構等方面的研究已有報道[6-7]，但對雙砧木嫁接和中間砧嫁接的西瓜植株根系微生物結構等方面的研究鮮有報道[8]。根際土壤微生物與連作存在著密切關系，也會影響到微生物生物量的積累、土壤酶活性及根系分泌物的釋放[9]。通過優(yōu)良砧木嫁接調節(jié)根際土壤的微生物種群結構，也是克服西瓜連作障礙的有效途徑。有研究表明，嫁接根系分泌物可降低土壤酶活性；抗性砧木與接穗之間存在著互作效應，土壤微生物群落影響著根際病原菌的數量[10-12]。因此，筆者通過檢測分析兩種西瓜嫁接處理的根際土壤生物學性狀及細菌群落結構，以期揭示雙砧木嫁接、中間砧嫁接增強植株抗性的機制，為進一步有效利用雙砧木嫁接技術防控土傳病害提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的西瓜品種為寧農科1 號（由寧夏農林科學院園藝研究所提供），砧木為白籽南瓜品種早生西砧（購于寧夏銀川市西北農資城）和野生西瓜（所用材料PI 189225 由國家園藝種質資源庫提供）。

1.2 試驗設計

試驗于2021 年2-8 月在寧夏吳忠市利通區(qū)高閘瓜菜試驗基地開展。試驗田前茬作物為水稻，土壤有機質含量（w，后同）19.10 g·kg-1、堿解氮含量83.20 mg·kg-1、有效磷含量22.50 mg·kg-1、速效鉀含量137.30 mg·kg-1、全氮含量1.27 g·kg-1、全磷含量0.93 g·kg-1、全鉀含量49.50 g·kg-1、pH 為8.12，地力水平中等。

試驗采用單因素隨機區(qū)組設計，采用南瓜和野生西瓜雙根砧嫁接（以下簡稱“雙砧嫁接”）、白籽南瓜為根用砧木且野生西瓜作為中間砧嫁接（以下簡稱“中間砧嫁接”）2 種多砧木嫁接方式（如圖1），設置南瓜單砧木的常規(guī)嫁接為對照組CK，試驗小區(qū)采用完全隨機排列，設3 次重復，每個重復30 株，共9個小區(qū)，每個小區(qū)35 m2，株行距30 cm×2.0 m。生物菌劑按3 kg·hm-1與羊糞6000 kg·hm-1混合均勻，預濕后于2 月25 日施入定植行內。3 月10 日定植，田間管理同常規(guī)生產。

圖1 不同砧木嫁接處理示意圖Fig.1 Different stock grafting treatment diagram

1.3 測定項目與方法

1.3.1 土壤樣品采集方法 西瓜成熟采收后，采集各處理表層0～20 cm 的土樣，采樣時每個處理隨機采集12 株西瓜的根際土壤混樣，重復采樣3 次獲得3 個分析樣品。樣品過篩（40 目）后迅速裝入無菌自封袋密封，運至實驗室檢測土壤生物學性狀及細菌群落結構。

1.3.2 土壤微生物群落的測定方法 各處理根際土壤在培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)后，采用稀釋平板法測定微生物數量；細菌群落結構基于高通量測序分析完成。采用容量分析法測定微生物生物量碳；采用茚三酮比色法測定微生物生物量氮；采用磷鉬藍比色法測定微生物生物量磷。采用Hayano 的方法[13]測定β-葡糖苷酶活性，采用Ladd 的方法[14]測定氨肽酶活性，采用Bremner 的方法[15]測定磷酸酶活性。

1.4 數據統(tǒng)計分析

采用鄧肯氏新復極差檢驗法對數據進行多重比較分析。利用R 語言v 4.1.3 進行植株根際土壤細菌多樣性分析。

2 結果與分析

2.1 雙砧嫁接對根際土壤微生物生物學性狀的影響

2.1.1 不同嫁接處理微生物數量的變化 由表1可知，中間砧嫁接和雙砧嫁接處理的根際土壤中細菌數量均顯著高于單砧嫁接對照，雙砧嫁接西瓜處理的細菌數量與中間砧嫁接處理的差異不顯著。雙砧嫁接西瓜的根際土壤中的放線菌數量顯著高于其他兩個處理，比CK 提高36.64%。

表1 雙砧木嫁接對西瓜根際土壤微生物數量的影響Table 1 Effect of double rootstock grafting on the microbial quantity of watermelon rhizosphere soil（×106CFU·g-1）

2.1.2 不同嫁接處理土壤生物量的變化 由表2可知，3 種嫁接處理的根際土壤中微生物生物量碳和氮含量均表現為雙砧嫁接＞中間砧嫁接＞單砧嫁接對照，且3 種嫁接處理之間均存在顯著差異。3 種嫁接處理的根際土壤中微生物生物量磷含量表現為雙砧嫁接＞單砧嫁接＞中間砧嫁接，雙砧嫁接處理顯著高于其他2 個處理，中間砧嫁接與單砧嫁接對照處理無顯著差異。由此可以看出，雙砧嫁接處理有助于富集根際土壤中3 種微生物生物量。

表2 雙砧嫁接對西瓜根際土壤生物量碳、氮、磷含量的影響Table 2 Effects of double stock grafting on biomass C，N，P in watermelon rhizosphere soil （mg·kg-1）

2.1.3 不同嫁接處理土壤酶活性的變化 由表3可知，雙砧嫁接處理的根際土壤中β-葡糖苷酶、氨肽酶、磷酸酶活性均顯著高于單砧嫁接處理。中間砧嫁接和雙砧嫁接處理間β-葡糖苷酶、氨肽酶活性差異顯著，但二者間磷酸酶活性無顯著差異。中間砧嫁接處理的β-葡糖苷酶、氨肽酶活性與單砧嫁接對照差異不顯著，但其磷酸酶活性顯著高于單砧嫁接對照處理，中間砧嫁接和雙砧嫁接處理間磷酸酶活性差異不顯著。由此可以看出，雙砧嫁接有助于提高根際土壤相關酶活性，根際土壤β-葡糖苷酶、氨肽酶、磷酸酶活性分別比CK 提高9.01%、16.07%和13.14%。

表3 雙砧木嫁接對西瓜根際土壤酶活性的影響Table 3 Effects of grafting on enzyme activities in watermelon rhizosphere soil （nmol·g-1·min-1）

2.2 雙砧木嫁接對根際土壤細菌群落結構的影響

2.2.1 不同處理對根際土壤細菌多樣性的影響由表4 可知，3 個處理的樣本文庫覆蓋率均在98.1%以上，結果可代表真實情況。雙砧嫁接處理除辛普森指數顯著低于單砧嫁接和中間砧嫁接處理外，其他3 個指數均顯著高于單砧嫁接和中間砧嫁接處理，但中間砧嫁接和單砧嫁接處理的4 個指數之間均無顯著差異。表明雙砧嫁接處理可顯著提高細菌的豐富度。

表4 不同嫁接處理根際土壤細菌的多樣性指數Table 4 Diversity index of rhizosphere soil bacteria under different grafting treatments

2.2.2 不同處理的細菌門分類水平的優(yōu)勢菌群分析 分析不同處理的細菌門分類水平結構可知，在單砧嫁接、中間砧嫁接和雙砧嫁接3 個處理根際土壤中，共有的優(yōu)勢細菌門有12 個。由表5 可知，3個處理中的變形菌門占比最高，分別占比達30.24%、33.04%、32.32%，其次是酸桿菌門、綠彎菌門、放線細菌門，這4 個優(yōu)勢細菌門占比均超過10%以上。

表5 不同處理的細菌門分類水平結構占比Table 5 Proportion of bacterial phylum classification level structure under different treatments %

各處理間酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloreflexi）占比差異不顯著。中間砧嫁接處理中的變形菌門（Proteobacteria）、放線細菌門（Actinobacteria）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、匿桿菌門（Latescibacteria）占比顯著高于單砧嫁接對照處理；但單砧嫁接對照處理中的厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）占比卻顯著高于中間砧嫁接處理。雙砧嫁接處理中的厚壁菌門（Firmicutes）占比與對照處理差異不顯著；但雙砧嫁接處理中的變形菌門（Proteobacteria）、螺旋體菌門（Saccharibacteria）占比顯著高于單砧嫁接，說明嫁接改變了這幾個優(yōu)勢細菌門的占比。

2.2.3 基于屬分類水平的優(yōu)勢菌群分析 由表6可知，有10 個優(yōu)勢細菌屬占比大于1%。對細菌屬分類水平共有優(yōu)勢細菌結構占比分析發(fā)現，norank_c_Acidobacteria 在根際土壤中占比最高，中間砧嫁接處理占比為7.04%，雙砧嫁接處理占比為5.43%。其中，單砧嫁接植株根際土壤中芽孢桿菌屬（Bacillus）的占比為4.36%，顯著高于中間砧嫁接（2.96%）和雙砧嫁接（2.93%）。

表6 細菌屬分類水平共有優(yōu)勢細菌結構占比Table 6 Proportion of dominant bacterial structures at the classification level of bacterial genera %

雙砧嫁接處理的norank_f_Xanthobacteraceae、norank_o_SC-I-84、norank_f_Nitrosomonadaceae 占比顯著高于中間砧嫁接和單砧嫁接處理；中間砧嫁接處理中的norank_c_Acidobacteria、硝化螺菌屬（Nitrospira）、norank_o_Gaiellales 占比顯著高于其他兩個處理。但各處理間的norank_f_Anaerolineaceae 占比差異不顯著。

2.2.4 基于OTU 水平的Venn 分析 通過統(tǒng)計不同處理樣本中所共有及獨有的可操作性分類單元數量并繪制Venn 圖。由圖4 可知，西瓜單砧嫁接、中間砧嫁接和雙砧木嫁接3 個處理的根際土壤中細菌總OTU 數量分別為1895、2076 和2246。其中，共有的OTU 數量為1794，西瓜單砧嫁接、中間砧嫁接和雙砧木嫁接處理的根際土壤中特有的細菌OTU 數量分別為12、53 和204。結果表明，雙砧嫁接和中間砧嫁接均能夠明顯增加西瓜根際土壤中特有的優(yōu)勢細菌數量，這可能是嫁接提高抗性的主要機制。

圖4 細菌OTU 分類水平Venn 圖Fig.4 Venn plot of bacterial OTU classification level

3 討論與結論

筆者在試驗中發(fā)現，雙砧嫁接處理的根系分泌物較自根西瓜顯著抑制病菌群落的生長，尤其是雙砧嫁接提高了西瓜土壤磷酸酶活性和微生物數量，具有抑制菌絲生長的化感物質，這與尹玉玲等[9]在茄子上的研究一致。且雙砧嫁接處理有助于富集根際土壤中微生物生物量碳、微生物生物量氮、微生物生物量磷，表明砧穗間存在著互作效應，但在向接穗傳遞過程中有一定程度的降低，這與符厚隆等[10]在冬瓜嫁接試驗中的結果相近。雙砧木嫁接處理和中間砧嫁接處理根際土壤中碳、氮、磷含量均顯著高于單砧嫁接處理，且能夠改善西瓜根際土壤微環(huán)境，提高根際土壤相關酶活性。但雙砧嫁接對西瓜枯萎病菌（尖孢鐮刀菌數量）的影響差異還需進一步研究。

除微生物生物量磷無顯著差異外，雙砧嫁接處理碳、氮表現顯著高于中間砧嫁接西瓜處理。與西瓜單砧嫁接處理相比，中間砧嫁接和雙砧嫁接改變了這幾個優(yōu)勢細菌門的占比，比如變形菌門、放線細菌門、硝化螺旋菌門等。同時，雙砧嫁接擁有豐富的特有OTU 數量及不同占比的共有優(yōu)勢細菌門屬。砧木與接穗通過相互調節(jié)，緩解脅迫因子的傷害，可能是雙砧嫁接提高抗性的主要機制[11-12]。

本研究結果表明，雙砧嫁接處理根際土壤中微生物生物量碳、微生物生物量氮、微生物生物量磷含量均顯著高于其他處理；雙砧嫁接處理根際土壤中特有分類操作單元OTU 數量為204，微生物菌門有2 個，分別為變形菌門（Proteobacteria）、螺旋體菌門（Saccharibacteria），不同占比的共有優(yōu)勢細菌門屬為norank_f_Xanthobacteraceae、norank_o_SC-I-84、norank_f_Nitrosomonadaceae。中間砧嫁接處理根際土壤微生物群落的覆蓋度較大，但其豐富度與群落多樣性低于雙砧嫁接處理。中間砧嫁接處理根際微生物生物量也發(fā)生了改變，砧木根系分泌物富集并改變了土壤細菌門屬。與之相比，雙砧嫁接處理根際土壤物質代謝旺盛，提高了西瓜根際土壤養(yǎng)分有效性，根際土壤磷酸酶等酶活性也得到提高，改善了根際土壤微環(huán)境。本研究為進一步研究抗性機制和雙砧木嫁接技術的利用提供了理論依據。