郭 松，于 蓉，董 瑞，李 程，田 梅

（寧夏農(nóng)林科學(xué)院園藝研究所 銀川 750002）

土壤中微生物種群和數(shù)量是土壤微生態(tài)環(huán)境的重要組成部分。西瓜根際土壤中的微生態(tài)環(huán)境與枯萎病等土傳病害的抗性機(jī)制密切相關(guān)。西瓜枯萎病等土傳病害的發(fā)生概率及危害程度受到土壤中微生物種群比例的影響[1-2]。土壤微生物群落中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)占比70%以上，其在養(yǎng)分循環(huán)、防控土傳病害等方面發(fā)揮重要作用[3]。西瓜嫁接處理后，砧木和西瓜接穗的互作會(huì)影響根系分泌物，使土壤中的微生物組成發(fā)生變化[4-5]。

西瓜嫁接技術(shù)比較廣泛地應(yīng)用到生產(chǎn)中，其對(duì)根際土壤微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)等方面的研究已有報(bào)道[6-7]，但對(duì)雙砧木嫁接和中間砧嫁接的西瓜植株根系微生物結(jié)構(gòu)等方面的研究鮮有報(bào)道[8]。根際土壤微生物與連作存在著密切關(guān)系，也會(huì)影響到微生物生物量的積累、土壤酶活性及根系分泌物的釋放[9]。通過優(yōu)良砧木嫁接調(diào)節(jié)根際土壤的微生物種群結(jié)構(gòu)，也是克服西瓜連作障礙的有效途徑。有研究表明，嫁接根系分泌物可降低土壤酶活性；抗性砧木與接穗之間存在著互作效應(yīng)，土壤微生物群落影響著根際病原菌的數(shù)量[10-12]。因此，筆者通過檢測(cè)分析兩種西瓜嫁接處理的根際土壤生物學(xué)性狀及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，以期揭示雙砧木嫁接、中間砧嫁接增強(qiáng)植株抗性的機(jī)制，為進(jìn)一步有效利用雙砧木嫁接技術(shù)防控土傳病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的西瓜品種為寧農(nóng)科1 號(hào)（由寧夏農(nóng)林科學(xué)院園藝研究所提供），砧木為白籽南瓜品種早生西砧（購于寧夏銀川市西北農(nóng)資城）和野生西瓜（所用材料PI 189225 由國家園藝種質(zhì)資源庫提供）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2021 年2-8 月在寧夏吳忠市利通區(qū)高閘瓜菜試驗(yàn)基地開展。試驗(yàn)田前茬作物為水稻，土壤有機(jī)質(zhì)含量（w，后同）19.10 g·kg-1、堿解氮含量83.20 mg·kg-1、有效磷含量22.50 mg·kg-1、速效鉀含量137.30 mg·kg-1、全氮含量1.27 g·kg-1、全磷含量0.93 g·kg-1、全鉀含量49.50 g·kg-1、pH 為8.12，地力水平中等。

試驗(yàn)采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，采用南瓜和野生西瓜雙根砧嫁接（以下簡稱“雙砧嫁接”）、白籽南瓜為根用砧木且野生西瓜作為中間砧嫁接（以下簡稱“中間砧嫁接”）2 種多砧木嫁接方式（如圖1），設(shè)置南瓜單砧木的常規(guī)嫁接為對(duì)照組CK，試驗(yàn)小區(qū)采用完全隨機(jī)排列，設(shè)3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30 株，共9個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)35 m2，株行距30 cm×2.0 m。生物菌劑按3 kg·hm-1與羊糞6000 kg·hm-1混合均勻，預(yù)濕后于2 月25 日施入定植行內(nèi)。3 月10 日定植，田間管理同常規(guī)生產(chǎn)。

圖1 不同砧木嫁接處理示意圖Fig.1 Different stock grafting treatment diagram

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 土壤樣品采集方法 西瓜成熟采收后，采集各處理表層0～20 cm 的土樣，采樣時(shí)每個(gè)處理隨機(jī)采集12 株西瓜的根際土壤混樣，重復(fù)采樣3 次獲得3 個(gè)分析樣品。樣品過篩（40 目）后迅速裝入無菌自封袋密封，運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)土壤生物學(xué)性狀及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

1.3.2 土壤微生物群落的測(cè)定方法 各處理根際土壤在培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)后，采用稀釋平板法測(cè)定微生物數(shù)量；細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)基于高通量測(cè)序分析完成。采用容量分析法測(cè)定微生物生物量碳；采用茚三酮比色法測(cè)定微生物生物量氮；采用磷鉬藍(lán)比色法測(cè)定微生物生物量磷。采用Hayano 的方法[13]測(cè)定β-葡糖苷酶活性，采用Ladd 的方法[14]測(cè)定氨肽酶活性，采用Bremner 的方法[15]測(cè)定磷酸酶活性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析。利用R 語言v 4.1.3 進(jìn)行植株根際土壤細(xì)菌多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙砧嫁接對(duì)根際土壤微生物生物學(xué)性狀的影響

2.1.1 不同嫁接處理微生物數(shù)量的變化 由表1可知，中間砧嫁接和雙砧嫁接處理的根際土壤中細(xì)菌數(shù)量均顯著高于單砧嫁接對(duì)照，雙砧嫁接西瓜處理的細(xì)菌數(shù)量與中間砧嫁接處理的差異不顯著。雙砧嫁接西瓜的根際土壤中的放線菌數(shù)量顯著高于其他兩個(gè)處理，比CK 提高36.64%。

表1 雙砧木嫁接對(duì)西瓜根際土壤微生物數(shù)量的影響Table 1 Effect of double rootstock grafting on the microbial quantity of watermelon rhizosphere soil（×106CFU·g-1）

2.1.2 不同嫁接處理土壤生物量的變化 由表2可知，3 種嫁接處理的根際土壤中微生物生物量碳和氮含量均表現(xiàn)為雙砧嫁接＞中間砧嫁接＞單砧嫁接對(duì)照，且3 種嫁接處理之間均存在顯著差異。3 種嫁接處理的根際土壤中微生物生物量磷含量表現(xiàn)為雙砧嫁接＞單砧嫁接＞中間砧嫁接，雙砧嫁接處理顯著高于其他2 個(gè)處理，中間砧嫁接與單砧嫁接對(duì)照處理無顯著差異。由此可以看出，雙砧嫁接處理有助于富集根際土壤中3 種微生物生物量。

表2 雙砧嫁接對(duì)西瓜根際土壤生物量碳、氮、磷含量的影響Table 2 Effects of double stock grafting on biomass C，N，P in watermelon rhizosphere soil （mg·kg-1）

2.1.3 不同嫁接處理土壤酶活性的變化 由表3可知，雙砧嫁接處理的根際土壤中β-葡糖苷酶、氨肽酶、磷酸酶活性均顯著高于單砧嫁接處理。中間砧嫁接和雙砧嫁接處理間β-葡糖苷酶、氨肽酶活性差異顯著，但二者間磷酸酶活性無顯著差異。中間砧嫁接處理的β-葡糖苷酶、氨肽酶活性與單砧嫁接對(duì)照差異不顯著，但其磷酸酶活性顯著高于單砧嫁接對(duì)照處理，中間砧嫁接和雙砧嫁接處理間磷酸酶活性差異不顯著。由此可以看出，雙砧嫁接有助于提高根際土壤相關(guān)酶活性，根際土壤β-葡糖苷酶、氨肽酶、磷酸酶活性分別比CK 提高9.01%、16.07%和13.14%。

表3 雙砧木嫁接對(duì)西瓜根際土壤酶活性的影響Table 3 Effects of grafting on enzyme activities in watermelon rhizosphere soil （nmol·g-1·min-1）

2.2 雙砧木嫁接對(duì)根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 不同處理對(duì)根際土壤細(xì)菌多樣性的影響由表4 可知，3 個(gè)處理的樣本文庫覆蓋率均在98.1%以上，結(jié)果可代表真實(shí)情況。雙砧嫁接處理除辛普森指數(shù)顯著低于單砧嫁接和中間砧嫁接處理外，其他3 個(gè)指數(shù)均顯著高于單砧嫁接和中間砧嫁接處理，但中間砧嫁接和單砧嫁接處理的4 個(gè)指數(shù)之間均無顯著差異。表明雙砧嫁接處理可顯著提高細(xì)菌的豐富度。

表4 不同嫁接處理根際土壤細(xì)菌的多樣性指數(shù)Table 4 Diversity index of rhizosphere soil bacteria under different grafting treatments

2.2.2 不同處理的細(xì)菌門分類水平的優(yōu)勢(shì)菌群分析 分析不同處理的細(xì)菌門分類水平結(jié)構(gòu)可知，在單砧嫁接、中間砧嫁接和雙砧嫁接3 個(gè)處理根際土壤中，共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門有12 個(gè)。由表5 可知，3個(gè)處理中的變形菌門占比最高，分別占比達(dá)30.24%、33.04%、32.32%，其次是酸桿菌門、綠彎菌門、放線細(xì)菌門，這4 個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門占比均超過10%以上。

表5 不同處理的細(xì)菌門分類水平結(jié)構(gòu)占比Table 5 Proportion of bacterial phylum classification level structure under different treatments %

各處理間酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloreflexi）占比差異不顯著。中間砧嫁接處理中的變形菌門（Proteobacteria）、放線細(xì)菌門（Actinobacteria）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、匿桿菌門（Latescibacteria）占比顯著高于單砧嫁接對(duì)照處理；但單砧嫁接對(duì)照處理中的厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）占比卻顯著高于中間砧嫁接處理。雙砧嫁接處理中的厚壁菌門（Firmicutes）占比與對(duì)照處理差異不顯著；但雙砧嫁接處理中的變形菌門（Proteobacteria）、螺旋體菌門（Saccharibacteria）占比顯著高于單砧嫁接，說明嫁接改變了這幾個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門的占比。

2.2.3 基于屬分類水平的優(yōu)勢(shì)菌群分析 由表6可知，有10 個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬占比大于1%。對(duì)細(xì)菌屬分類水平共有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌結(jié)構(gòu)占比分析發(fā)現(xiàn)，norank_c_Acidobacteria 在根際土壤中占比最高，中間砧嫁接處理占比為7.04%，雙砧嫁接處理占比為5.43%。其中，單砧嫁接植株根際土壤中芽孢桿菌屬（Bacillus）的占比為4.36%，顯著高于中間砧嫁接（2.96%）和雙砧嫁接（2.93%）。

表6 細(xì)菌屬分類水平共有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌結(jié)構(gòu)占比Table 6 Proportion of dominant bacterial structures at the classification level of bacterial genera %

雙砧嫁接處理的norank_f_Xanthobacteraceae、norank_o_SC-I-84、norank_f_Nitrosomonadaceae 占比顯著高于中間砧嫁接和單砧嫁接處理；中間砧嫁接處理中的norank_c_Acidobacteria、硝化螺菌屬（Nitrospira）、norank_o_Gaiellales 占比顯著高于其他兩個(gè)處理。但各處理間的norank_f_Anaerolineaceae 占比差異不顯著。

2.2.4 基于OTU 水平的Venn 分析 通過統(tǒng)計(jì)不同處理樣本中所共有及獨(dú)有的可操作性分類單元數(shù)量并繪制Venn 圖。由圖4 可知，西瓜單砧嫁接、中間砧嫁接和雙砧木嫁接3 個(gè)處理的根際土壤中細(xì)菌總OTU 數(shù)量分別為1895、2076 和2246。其中，共有的OTU 數(shù)量為1794，西瓜單砧嫁接、中間砧嫁接和雙砧木嫁接處理的根際土壤中特有的細(xì)菌OTU 數(shù)量分別為12、53 和204。結(jié)果表明，雙砧嫁接和中間砧嫁接均能夠明顯增加西瓜根際土壤中特有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌數(shù)量，這可能是嫁接提高抗性的主要機(jī)制。

圖4 細(xì)菌OTU 分類水平Venn 圖Fig.4 Venn plot of bacterial OTU classification level

3 討論與結(jié)論

筆者在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，雙砧嫁接處理的根系分泌物較自根西瓜顯著抑制病菌群落的生長，尤其是雙砧嫁接提高了西瓜土壤磷酸酶活性和微生物數(shù)量，具有抑制菌絲生長的化感物質(zhì)，這與尹玉玲等[9]在茄子上的研究一致。且雙砧嫁接處理有助于富集根際土壤中微生物生物量碳、微生物生物量氮、微生物生物量磷，表明砧穗間存在著互作效應(yīng)，但在向接穗傳遞過程中有一定程度的降低，這與符厚隆等[10]在冬瓜嫁接試驗(yàn)中的結(jié)果相近。雙砧木嫁接處理和中間砧嫁接處理根際土壤中碳、氮、磷含量均顯著高于單砧嫁接處理，且能夠改善西瓜根際土壤微環(huán)境，提高根際土壤相關(guān)酶活性。但雙砧嫁接對(duì)西瓜枯萎病菌（尖孢鐮刀菌數(shù)量）的影響差異還需進(jìn)一步研究。

除微生物生物量磷無顯著差異外，雙砧嫁接處理碳、氮表現(xiàn)顯著高于中間砧嫁接西瓜處理。與西瓜單砧嫁接處理相比，中間砧嫁接和雙砧嫁接改變了這幾個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門的占比，比如變形菌門、放線細(xì)菌門、硝化螺旋菌門等。同時(shí)，雙砧嫁接擁有豐富的特有OTU 數(shù)量及不同占比的共有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門屬。砧木與接穗通過相互調(diào)節(jié)，緩解脅迫因子的傷害，可能是雙砧嫁接提高抗性的主要機(jī)制[11-12]。

本研究結(jié)果表明，雙砧嫁接處理根際土壤中微生物生物量碳、微生物生物量氮、微生物生物量磷含量均顯著高于其他處理；雙砧嫁接處理根際土壤中特有分類操作單元OTU 數(shù)量為204，微生物菌門有2 個(gè)，分別為變形菌門（Proteobacteria）、螺旋體菌門（Saccharibacteria），不同占比的共有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門屬為norank_f_Xanthobacteraceae、norank_o_SC-I-84、norank_f_Nitrosomonadaceae。中間砧嫁接處理根際土壤微生物群落的覆蓋度較大，但其豐富度與群落多樣性低于雙砧嫁接處理。中間砧嫁接處理根際微生物生物量也發(fā)生了改變，砧木根系分泌物富集并改變了土壤細(xì)菌門屬。與之相比，雙砧嫁接處理根際土壤物質(zhì)代謝旺盛，提高了西瓜根際土壤養(yǎng)分有效性，根際土壤磷酸酶等酶活性也得到提高，改善了根際土壤微環(huán)境。本研究為進(jìn)一步研究抗性機(jī)制和雙砧木嫁接技術(shù)的利用提供了理論依據(jù)。