余清蓮

福建省三明市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，福建 三明 365000

防芷鼻炎片由蒼耳子、野菊花、鵝不食草等十味中藥制成，用于治療慢性鼻炎引起的噴嚏、鼻塞、頭痛、過敏性鼻炎、慢性鼻竇[1]。防芷鼻炎片的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[2]對(duì)性狀、化學(xué)鑒別做出了相關(guān)規(guī)定，相關(guān)文獻(xiàn)主要對(duì)蒼耳子、白芷、墨旱蓮、野菊花、白芍及防風(fēng)的薄層色譜鑒別[3-5]、HPLC測(cè)定芍藥苷的含量[6]、HPLC測(cè)定歐前胡素、異歐前胡素的含量[7]及RRLC測(cè)定蒙花苷、芍藥苷的含量[8]等方面展開研究。防芷鼻炎片組方復(fù)雜，僅是鑒別、檢查、單個(gè)成分或兩個(gè)成分的含量測(cè)定難以全面反應(yīng)該藥的質(zhì)量。因此，實(shí)驗(yàn)基于中醫(yī)方劑配伍組成的基本原則，選取君藥蒼耳子的質(zhì)量標(biāo)志物的綠原酸、咖啡酸[9]，臣藥野菊花的質(zhì)量標(biāo)志物蒙花苷[10]，臣藥白芍的質(zhì)量標(biāo)志物芍藥苷，佐藥防風(fēng)藥效的質(zhì)量標(biāo)志物升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷[11]為指標(biāo)性成分，探索同時(shí)測(cè)定上述指標(biāo)成分的含量測(cè)定方法，以期為更全面地控制防芷鼻炎片的質(zhì)量提供科學(xué)參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 1260高效液相色譜儀(安捷倫公司)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州榮華儀器制造有限公司)；CPA324S電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器公司)。

1.2 材料 綠原酸 (批號(hào)：110831-201906，含量91.5%)、咖啡酸 (批號(hào)：110753-201716，含量99.3%)、芍藥苷 (批號(hào)：110736-201943，含量95.1%)、升麻素苷 (批號(hào)110885-201703)、5-O-甲基維斯阿米醇苷(批號(hào)：11924-201806，含量99.5%)、蒙花苷(批號(hào)：11924-201806，含量99.5%)。甲醇(色譜純、分析純)、甲酸(分析純)、醋酸(分析純)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：unitary C18柱 (4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)-0.5%醋酸溶液(B)；梯度洗脫(0～10 min：20%A；10～40 min：20%A→35%A；40～55 min：35%A→45%A；55～68 min：45%A→55%A)；流速：1 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL；波長(zhǎng)：0～21 min 323 nm、21～30 min 230 nm、30～60 min 254 nm、60 min后 330 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取防芷鼻炎片20片，除去糖衣，稱取重量后(平均片重為2.993 g)，研磨成細(xì)粉，取0.6 g，精密加入甲酸-50%甲醇(1∶20)混合溶液25 mL，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，稱重，用甲酸-50%甲醇(1∶20)混合溶液補(bǔ)足失重，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸12.86 mg、咖啡酸12.91 mg、芍藥苷12.6 mg、升麻素苷15.27 mg、5-O-甲基維斯阿米醇苷10.08 mg、蒙花苷9.51 mg，分別加入甲醇50 mL，配成對(duì)照品貯備液。取上述貯備液適量，加甲醇稀釋成每mL含綠原酸10.29 μg、咖啡酸3.1 μg、芍藥苷100.8 μg、升麻素苷12.216 μg、5-O-甲基維斯阿米醇苷4.032 μg、蒙花苷20.76 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)[11]精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)的條件檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果如圖1、圖2所示。在供試品溶液的色譜圖上，有與對(duì)照品保留時(shí)間一致的色譜峰，且色譜報(bào)告中顯示：各色譜峰的理論塔板數(shù)高于6500，分離度高于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之間。表明該方法的系統(tǒng)適用性良好。

圖1 供試品溶液色譜圖

圖2 對(duì)照品溶液色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系 精密吸取混合對(duì)照品溶液3 μL、6 μL、9 μL、12 μL、15 μL，分別按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品的含有量及相應(yīng)的峰面積為橫、縱坐標(biāo)，繪制咖啡酸、綠原酸、芍藥苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、蒙花苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸?；貧w方程見表1。

表1 線性回歸方程

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別在0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h精密吸取2.2.1項(xiàng)供試液10 μL，進(jìn)樣測(cè)定，綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、蒙花苷峰面積的RSD分別為1.5%、2.1%、0.9%、1.6%、1.2%、1.8%，供試品溶液24 h內(nèi)含量穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取防芷鼻炎片細(xì)粉6份，每份0.6 g，按“2.2.1”項(xiàng)方法制備6份供試品溶液，在“2.1”色譜條件下測(cè)定，每片含綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、蒙花苷量的平均值(RSD)分別為0.27 mg(1.2%)、0.04 mg(2.0%)、2.1 mg(1.0%)、0.13 mg(1.2%)、0.20 mg(1.6%)、0.61 mg(0.8%)。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 連續(xù)吸取“2.2.1”項(xiàng)供試品溶6次，每次10 μL，在“2.1”色譜條件下測(cè)定，綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、蒙花苷峰面積的RSD分別為1.0%、1.5%、0.9%、1.0%、0.8%、1.5%。

2.3.6 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的防芷鼻炎片細(xì)粉6份，每份0.3 g，分別精密加入適量的綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、蒙花苷對(duì)照品，依“2.2.1”項(xiàng)的方法制備相當(dāng)于100%濃度水平的供試液，在2.1色譜條件下測(cè)定。對(duì)照品加入量及測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.4 樣品測(cè)定及結(jié)果分析 取防芷鼻炎片6批(R廠家：20220101，20230301；T廠家：220202，230101；B廠家：E22S003，E22S001)，依“2.2.1”項(xiàng)下方法制成供試液，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)行檢測(cè)，6批樣品中6種成分的含量測(cè)定結(jié)果折線圖如圖3所示。從圖中可看出：同一廠家不同批號(hào)的樣品的各成分的含量差異不顯著，而不同廠家生產(chǎn)的樣品各成分的含量都有差異，尤其是R廠家的樣品中芍藥苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷及蒙花苷的含量遠(yuǎn)高于T和B廠家。

圖3 含量測(cè)定結(jié)果折線圖

3 討論

3.1 樣品溶液的制備 溶劑的選擇上，分別考察了70%乙醇溶液、100%甲醇溶液、甲酸-50%甲醇(1∶20)混合溶液和甲酸-70%甲醇(1∶20)混合溶液，70%乙醇溶液和100%甲醇溶液對(duì)綠原酸、咖啡酸的提取效率低，甲酸-50%甲醇(1∶20)混合溶液對(duì)各成分的提取效率明顯優(yōu)于甲酸-70%甲醇(1∶20)混合溶液。提取方式上，比較了超聲和加熱回流兩種方法，與超聲提取的樣品比較，加熱回流提取的樣品中，蒙花苷的含量顯著提高，其他成分的含量略有提升。這可能與蒙花苷溶解性能有關(guān)，溫度較高的條件下，其在甲醇中的溶解度升高；基于上述原因，選取甲酸-70%甲醇(1∶20)混合溶液為溶劑，采用加熱回流的提取方式。

3.2 流動(dòng)相及洗脫方式的選擇 流動(dòng)相的選擇上，依綠原酸、咖啡酸等6種組分的化學(xué)性質(zhì)，選取甲醇-水、甲醇-0.5%醋酸溶液和甲醇-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相考察對(duì)象，發(fā)現(xiàn)：以甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)，樣品中綠原酸和咖啡酸峰面積小、峰形不佳；以甲醇-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，芍藥苷和升麻素苷的峰形對(duì)稱性欠佳；而以甲醇-0.5%醋酸溶液洗脫，6個(gè)組分色譜峰的峰形對(duì)稱，分離度佳，且峰面積均較大；洗脫方式上，因各組分的極性相差較大，等度洗脫需要耗費(fèi)更多的溶劑和時(shí)間，故選擇梯度洗脫。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)選取甲醇-0.5%醋酸溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 通過對(duì)防芷鼻炎片供試品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描分析，確定了干擾小、強(qiáng)吸收的波長(zhǎng)，分別為323 nm(綠原酸、咖啡酸)、230 nm(芍藥苷)、254 nm(升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷)、330 nm(蒙花苷)；查看樣品溶液的離線3D(時(shí)間、波長(zhǎng)、峰面積)視圖，發(fā)現(xiàn)在21 min、30 min、60 min切換波長(zhǎng)，所得的色譜圖基線平穩(wěn)、色譜峰分離度高。

4 結(jié)論

使用HPLC梯度洗脫-切換波長(zhǎng)法對(duì)3個(gè)廠家6個(gè)批號(hào)的防芷鼻炎片進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，防芷鼻炎片中的6個(gè)指標(biāo)性成分均能在同一個(gè)色譜系統(tǒng)中同時(shí)出峰，且結(jié)果穩(wěn)定、分離效能高。因此，HPLC梯度洗脫-切換波長(zhǎng)法可作為防芷鼻炎片6種成分的含量測(cè)定方法。此方法的建立，有利于更全面控制防芷鼻炎片的質(zhì)量，但仍存在不足。該方法所能測(cè)定的指標(biāo)成分并未覆蓋全方，且實(shí)驗(yàn)的樣本量也較少。因此，今后可結(jié)合指紋圖譜和藥理實(shí)驗(yàn)確定更多能反應(yīng)該藥藥效的質(zhì)量標(biāo)志物，測(cè)定覆蓋全方中藥材的指標(biāo)性成分含量，探索其成分之間的相關(guān)性，建立更高效更全面的含量測(cè)定方法。