孫艷杰 趙 磊 李正剛 王路宏

吉林省四平市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 四平 136000

馬腎藥材標(biāo)準(zhǔn)收載在《吉林省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》第二冊(cè)2019版[1]，為馬科動(dòng)物成年馬EquuscaballusLinnaeus雄性的干燥陰莖及睪丸。制馬腎為馬腎經(jīng)過(guò)滑石粉炒，祛除其腥味，便于保存和臨床應(yīng)用[2]。黃曲霉素(aflatoxins，AF)屬真菌毒素，是黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的雙呋喃環(huán)類毒素的次級(jí)代謝產(chǎn)物，以AF B1、B2、G1、G2較常見(jiàn)。AF的強(qiáng)致癌性，特別是AFB1，其毒性比氰化物、砷化物和有機(jī)農(nóng)藥等的毒性更大，已被世界衛(wèi)生組織癌癥研究機(jī)構(gòu)列為Ⅰ類致癌物質(zhì)[3-7]。黃曲霉性喜濕熱，中藥材及飲片潮濕季節(jié)，保存不當(dāng)，容易造成黃曲霉毒素污染，特別是含蛋白質(zhì)，油脂類的動(dòng)物類藥材更容易黃曲霉毒素超標(biāo)。《中國(guó)藥典》2020版一部中有較多動(dòng)物類藥材和飲片品種進(jìn)行了AF的限量控制，如地龍、蜂房、土鱉蟲(chóng)等[8-10]。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，未發(fā)現(xiàn)有關(guān)于馬腎相關(guān)真菌毒素的研究報(bào)道。為保證制馬腎的用藥安全，本次研究采用檢測(cè)靈敏度較高的免疫親和柱，柱后光化學(xué)衍生，高效液相色譜-熒光檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定制馬腎中AF B1、B2、G1、G2的含量，并進(jìn)行了方法考察研究，驗(yàn)證測(cè)定方法的可靠性，為臨床用藥安全提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 BT125D型電子天平(北京賽多利斯儀器天平有限公司)，Agilent LC 1260型高效液相色譜儀(配Agilent LC1260II型熒光檢測(cè)器，安捷倫科技有限公司)，KRC-25型光化學(xué)柱后衍生器(青島普瑞邦生物工程有限公司)，TDL-5-A型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 試驗(yàn)材料 黃曲霉混合對(duì)照品溶液(AF B1、B2、G1、G2標(biāo)示濃度分別為(1.04 μg/mL、0.38 μg/mL、1.08 μg/mL、0.38 μg/mL，批號(hào)：610001-202006，中國(guó)食品藥品檢定研究院)。10批制馬腎來(lái)源于炮制中式樣品。免疫親和柱(青島普瑞邦生物工程有限公司)。甲醇和乙腈(Flsher Scientific，色譜純)，純化水為自制，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 黃曲霉混合對(duì)照品工作溶液的制備 精密量取黃曲霉混合對(duì)照品溶液0.5 mL，置10 mL量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，作為貯備溶液。精密量取貯備溶液1 mL，置25 mL量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，即得黃曲霉混合對(duì)照品工作溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取供試品約15 g(剪碎)，精密稱定，置于均質(zhì)瓶中，加入氯化鈉3 g，精密加入70%甲醇溶液75 mL，12000 r/min高速攪拌2 min，4500 r/min離心5 min，精密量取上清液15 mL，置50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，4500 r/min離心10 min，精密量取續(xù)濾液10.0 mL，通過(guò)免疫親合柱，流速每分鐘3 mL，用水20 mL洗脫，洗脫液棄去，使空氣進(jìn)入，將水?dāng)D出免疫親合柱，再用適量甲醇洗脫，收集洗脫液，置2 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.22 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件及測(cè)定方法 采用Agilent ZORBAX SB-C18，5 μm，250 mm×4.6 mm；流動(dòng)相為：甲醇-乙腈-水(40∶18∶42)；流速為1.0 mL/min；柱溫為25 ℃；采用柱后光化學(xué)衍生法(254 nm)，以熒光檢測(cè)器檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)λex = 360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)λex = 450 nm。分別精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下黃曲霉混合對(duì)照品工作溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。另精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品中AF B1、B2、G1、G2的量，進(jìn)行計(jì)算。AF B1、B2、G1、G2的色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，且無(wú)雜質(zhì)干擾峰。結(jié)果如圖1所示。

(A)黃曲霉混合對(duì)照品 (B)樣品

圖1 黃曲霉 B1、B2、G1、G2色譜圖

2.3 線性范圍和檢出限 分別精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 4種黃曲霉毒素的線性、檢出限

取不含黃曲霉的樣品 15 g，加入適當(dāng)稀釋的黃曲霉混合對(duì)照品溶液，同供試品溶液制備、測(cè)定，以信噪比(S/N)為3作為4種黃曲霉毒素的檢出限(limit of detection，LOD)。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 精密度考察 取黃曲霉混合對(duì)照品工作溶液20 μL，注入液相色譜儀，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，分別計(jì)算黃曲霉B1、B2、G1、G2峰面積的RSD(n=6)分別為1.15%、1.08%、1.07%、1.31%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.6”項(xiàng)下供試品溶液，分別于0 h、4 h、8 h、16 h、18 h、24 h，按“2.2”色譜條件，進(jìn)樣20 μL，記錄所測(cè)各組分峰面積，黃曲霉 B1、B2、G1、G2峰面積的RSD(n=6)分別為1.82%、2.01%、1.91%、1.93%，結(jié)果表明對(duì)照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)及回收率試驗(yàn) 經(jīng)考察10批制馬腎中均未檢出黃曲霉B1、B2、G1、G2，故本次實(shí)驗(yàn)重復(fù)性在加樣回收的6個(gè)平行試驗(yàn)的同時(shí)進(jìn)行考察。取不含黃曲霉的供試品粉末約15 g，各6份，精密稱定，分別置于均質(zhì)瓶中，精密加入黃曲霉混合對(duì)照品儲(chǔ)備液75 μL，按“2.1.2”項(xiàng)下操作，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好，準(zhǔn)確度達(dá)到方法要求。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7 樣品測(cè)定 取10批次制馬腎樣品，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果均未檢出AF B1、B2、G1、G2。

3 討論

3.1 樣品提取方法考察 本實(shí)驗(yàn)分別采用勻質(zhì)法和超聲提取法進(jìn)行了制馬腎樣品中黃曲毒素的提取處理，結(jié)果勻質(zhì)提取法AF B1、B2、G1、G2平均回收率分別為96.1%、95.2%、93.8%、94.4%，超聲提取法AF B1、B2、G1、G2平均回收率分別為90.5%、89.1%、91.1%、90.6%?；厥章蕜蛸|(zhì)法優(yōu)于超聲提取法。且樣品的提取采用勻質(zhì)法，12000 r/min 高速攪拌2 min即可完成操作，而超聲提取法需要超聲30 min，提取效率較勻質(zhì)法低。故本次采用勻質(zhì)法進(jìn)行制馬腎樣品中黃曲霉毒素的提取。

3.2 色譜條件的考察 以甲醇-乙腈-水(40∶18∶42)；流速為1.0 mL/min-1；柱溫為25 ℃為色譜條件，分別考察了Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、YMC-Hydrosphere-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，3個(gè)不同品牌的色譜柱的測(cè)定效果。結(jié)果，AF B1、B2、G1、G2的分離度均達(dá)到2.0以上，塔板數(shù)均高于8000，表明方法的適用性較好。

3.3 黃曲霉檢測(cè)方法選擇 黃曲霉毒素有多種檢測(cè)分析方法，包括酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜-熒光法、膠體金快速定量法、實(shí)時(shí)熒光PCR方法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[11-13]。其中高效液相色譜-熒光法檢測(cè)應(yīng)用最為廣泛。在4種黃曲霉毒素中，AF B1和G1遇水熒光猝滅，需要先進(jìn)行柱后衍生化，來(lái)提高AF B1和G1的熒光強(qiáng)度，增強(qiáng)其靈敏度。柱后衍生法有碘衍生法和光化學(xué)衍生法兩種。碘衍生化法需要配制碘飽和溶液，且衍生劑有一定的腐蝕作用，也會(huì)造成基線的漂移，設(shè)備成本高。而光化學(xué)衍生操作簡(jiǎn)便、不需要衍生劑與衍生溫度，延長(zhǎng)檢測(cè)器壽命，購(gòu)置成本低，儀器配制簡(jiǎn)單，并且可以通過(guò)開(kāi)關(guān)光化學(xué)衍生器，AF B1和G1的信號(hào)響應(yīng)值變化來(lái)鑒別AF B1和G1假陽(yáng)性反應(yīng)，適用性更好。

本研究進(jìn)行了免疫親和柱凈化柱后光化學(xué)衍生高效液相色譜-熒光檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定中藥飲片制馬腎中AF B1、B2、G1、G24種黃曲霉毒素含量，并進(jìn)行了方法學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)驗(yàn)證，均滿足分析測(cè)定的要求。由于本次僅收集了10個(gè)批次樣品，雖然均未檢測(cè)出黃曲霉毒素，但馬腎為動(dòng)物類藥，蛋白質(zhì)含量高，濕熱環(huán)境下非常容易感染黃曲霉毒素，存儲(chǔ)溫度控制不好，會(huì)存在非常大的安全風(fēng)險(xiǎn)，故對(duì)其進(jìn)行AF的更多批次樣本和持續(xù)監(jiān)控檢測(cè)仍然具有非常大的意義[14-16]。