陳 壯 林憶龍* 韋世民 黃鴻敖 朱 閩 劉雪瑩 韋驍娟

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530001；2.右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西 百色 533000；3.廣西壯族自治區(qū)東蘭縣人民醫(yī)院藥劑科，廣西 東蘭 547400

尖銳濕疣(condyloma acuminatum，CA)是常見(jiàn)的性傳播疾病之一，臨床患者的復(fù)發(fā)率從9%至80%不等[1]。CA復(fù)發(fā)仍是臨床治療的一大挑戰(zhàn)，尋找更為安全有效的藥物用于CA的治療是亟待解決的問(wèn)題。壯醫(yī)藥在治療CA方面一直都有獨(dú)特的療效，同時(shí)具有毒副作用小、復(fù)發(fā)率低等優(yōu)勢(shì)[2-4]。壯醫(yī)認(rèn)為，CA多由外感毒邪，入侵肌膚，龍路、火路失調(diào)，外邪凝聚肌膚而致，主要病理因素為毒邪穢濁，故祛毒，通調(diào)龍路、火路乃基本治法。壯藥尖銳濕疣外洗劑為我院使用多年的臨床驗(yàn)方，具有良好的臨床效果，但該制劑尚未進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面研究。壯藥尖銳濕疣外洗劑由馬齒莧、鬼針草、白花蛇舌草和白花丹組成[5-7]；馬齒莧具有清熱毒、調(diào)龍路、止血、止痢的功效，鬼針草具有通谷道、解痧毒、清熱毒、散瘀毒的功效，二者共為主藥；白花蛇舌草可通龍路，解熱毒，除濕毒，散結(jié)消腫為幫藥；白花丹散瘀消腫，祛風(fēng)除濕，消炎止痛為帶藥。全方主幫帶合用，共奏祛毒、通調(diào)火路龍路、涼血除瘀之效，具有祛毒、通調(diào)火路、涼血除瘀之功。白花蛇舌草水溶性成分是主要的有效成分，而去乙酰車葉草酸甲酯是其水溶性成分之一[8]。本研究將建立壯藥尖銳濕疣外洗劑的HPLC法測(cè)定去乙酰車葉草酸甲酯的含量，并采用薄層鑒別法對(duì)方中白花蛇草和白花丹進(jìn)行定性鑒別。本研究建立的方法重現(xiàn)性好，簡(jiǎn)便、快捷，可有效的控制壯藥尖銳濕疣外洗劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 LC-2030 Plus高效液相色譜儀器(島津)，Shimadzu Shim-packGIST C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，AL204電子天平[梅特勒-托利多(上海)有限公司]，KQ-D250超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，101-38數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)，WFH-205B可見(jiàn)透身紫外反射儀(上海儀電)。

1.2 材料 去乙酰車葉草酸甲酯對(duì)照(批號(hào)：111786-201602，純度：94.3%)、白花蛇舌草對(duì)照藥材(批號(hào)：121183-201605)、白花丹對(duì)照藥材(批號(hào)：121370-200401)均購(gòu)自于中國(guó)食品藥品檢定研究院；壯藥尖銳濕疣外洗劑(批號(hào)：20211108、20211109、20211110)，陰性對(duì)照洗劑(白花蛇舌草、白花丹)均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院自制。甲醇和乙腈(Fisher，色譜純)，硅膠G薄層板(青島海洋化工有限公司、煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所)；其余試劑均為分析純?cè)噭?/p>

2 方法

2.1 溶液配制

2.1.1 去乙酰車葉草酸甲酯對(duì)照品溶液 精密稱取去乙酰車葉草酸甲酯對(duì)照品13.50 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇定容到刻度，即得0.5092mg/mL去乙酰車葉草酸甲酯對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 取壯藥尖銳濕疣外洗劑適量，13000轉(zhuǎn)離心10 min，即得。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液 取白花蛇舌草陰性對(duì)照溶液適量，13000轉(zhuǎn)離心10 min，即得。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性 試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水(4：96)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為：236 nm。理論板數(shù)按去乙酰車葉草酸甲酯峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.3 線性關(guān)系考察 精密移取去乙酰車葉草酸甲酯對(duì)照品溶液適量，加甲醇分別稀釋成濃度為0.2546 mg/mL、0.1273 mg/mL、0.07638 mg/mL、0.03819 mg/mL、0.01910 mg/mL的對(duì)照品溶液，取上述5個(gè)濃度對(duì)照品溶液和原液(0.5092 mg/mL)各進(jìn)樣5 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。以去乙酰車葉草酸甲酯峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行線性回歸。

3 結(jié)果與分析

3.1 去乙酰車葉草酸甲酯HPLC含量測(cè)定方法學(xué)考察

3.1.1 專屬性考察 取對(duì)照品(0.07638 mg/mL)、供試品和陰性對(duì)照溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分析，結(jié)果顯示，樣品中其他成分對(duì)去乙酰車葉草酸甲酯的測(cè)定無(wú)干擾(如圖1所示)。

A.對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對(duì)照溶液；1.去乙酰車葉草酸甲酯

3.1.2 線性關(guān)系考察 以去乙酰車葉草酸甲酯峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品溶液濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為：Y= 7.619×106X+ 1.772×104(R2=0.9999)，表明去乙酰車葉草酸甲酯在0.01910～0.5092 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.1.3 精密度考察 精密吸取同一濃度的去乙酰車葉草酸甲酯對(duì)照品溶液5 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果測(cè)得去乙酰車葉草酸甲酯的峰面積RSD值為0.21%，表明該方法精密度良好。

3.1.4 重復(fù)性考察 取同一批號(hào)的尖銳濕疣外洗劑6份，按照“2.1”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。測(cè)得去乙酰車葉草酸甲酯的含量RSD值為2.90%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.1.5 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h進(jìn)樣，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分析，測(cè)定去乙酰車葉草酸甲酯的含量。結(jié)果測(cè)得去乙酰車葉草酸甲酯的含量RSD值為3.58%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.1.6 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的壯藥尖銳濕疣外洗劑0.5 mL，精密移取，加入去乙酰車葉草酸甲酯對(duì)照品適量，混勻，按“2.1”項(xiàng)下平行制備6份供試品溶液，分別精密吸取5 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件下測(cè)定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1，去乙酰車葉草酸甲酯平均回收率為100.27%，RSD為3.32%。

表1 去乙酰車葉草酸甲酯加樣回收表

3.2 三批樣品測(cè)定 制備三批壯藥尖銳濕疣外洗劑(如圖2)，每批次取樣品2份，分別按“2.1”方法制備供試品溶液，按“2.2”色譜條件進(jìn)樣5 μL，以外標(biāo)法計(jì)算得到去乙酰車葉草酸甲酯的平均含量。見(jiàn)表2。

圖2 三批壯藥尖銳濕疣外洗劑樣品圖

表2 三批產(chǎn)品去乙酰車葉草酸甲酯平均含量表(n=2)

3.3 TCL定性鑒別結(jié)果

3.3.1 白花丹薄層鑒別[9]取壯藥尖銳濕疣外洗劑5 mL，水浴蒸干，加甲醇溶解，制成1 mL供試品溶液。取白花丹陰性對(duì)照溶液5 mL同法制得陰性對(duì)照溶液。另取白花丹對(duì)照藥材樣品1 g，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，取續(xù)濾液作為對(duì)照藥材溶液。按照《中華人民共和國(guó)藥典》 (通則0502)[10]試驗(yàn)，分別吸取供試品和陰性對(duì)照溶液3 μL，對(duì)照藥材溶液8 μL點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-三氯甲烷-甲醇(8∶4∶1)為展開(kāi)劑，預(yù)飽和10 min，展開(kāi)，取出晾干，噴2%三氯化鋁乙醇溶液，在105 ℃下加熱2 min，置于紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜顯相應(yīng)的位置上，顯相同顏色熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。如圖3所示。

1～3.供試品(20211108、20211109、20211110)；4.白花丹對(duì)照藥材；5.陰性對(duì)照

3.3.2 白花蛇舌草薄層鑒別[11]取壯藥尖銳濕疣外洗劑25 mL，水浴蒸干，加丙酮20 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，加乙醇溶解，制成1 mL供試品溶液。取白花蛇舌草陰性對(duì)照溶液25 mL同法制得陰性對(duì)照溶液。另取白花蛇舌草對(duì)照藥材0.5 g，丙酮20 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，加乙醇溶解，制成1 mL對(duì)照藥材溶液。按照《中華人民共和國(guó)藥典》(通則0502)[10]試驗(yàn)，分別吸取供試品和陰性對(duì)照溶液10 μL，對(duì)照藥材溶液4 μL點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮(7∶1)為展開(kāi)劑，預(yù)飽和15 min，展開(kāi)，取出晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃下加熱至斑點(diǎn)清晰，日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜顯相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。如圖4所示。

1～3.供試品(20211108、20211109、20211110)；4.白花蛇舌草對(duì)照藥材；5.陰性對(duì)照

4 討論

4.1 色譜指標(biāo)成分的選擇 壯藥尖銳濕疣外洗劑是以水為溶媒的制劑，在選擇HPLC測(cè)定尖銳濕疣外洗劑成分時(shí)，考慮選取白花蛇舌草的水溶性成分：4-香豆酸和去乙酰車葉草酸甲酯[8]，但處方中其它藥材也含有4-香豆酸，故制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)只選擇了去乙酰車葉草酸甲酯。

4.2 薄層色譜的考察 在白花丹薄層鑒別研究時(shí)，對(duì)展開(kāi)系統(tǒng)和顯色劑濃度進(jìn)行了考察，石油醚(30～60 ℃)-乙酸乙酯-冰醋酸(20∶2∶1)、石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-甲酸(30∶4∶1)為展開(kāi)劑，預(yù)飽和10 min展開(kāi)，供試品都均未出現(xiàn)與對(duì)照藥材相同的斑點(diǎn)。調(diào)整展開(kāi)劑比例為石油醚(30～60 ℃)-三氯甲烷-甲醇(8∶4∶1)，發(fā)現(xiàn)供試品和對(duì)照藥材斑點(diǎn)Rf值明顯偏大，斑點(diǎn)邊緣輪廓不清晰，最終確定展開(kāi)劑為石油醚(60～90 ℃)-三氯甲烷-甲醇(8∶4∶1)后，供試品色譜斑點(diǎn)清晰，分離度好。考察了顯色劑的濃度，5%三氯化鋁乙醇溶液顯色會(huì)覆蓋熒光斑點(diǎn)，2%三氯化鋁乙醇溶液顯色較好。同時(shí)，課題組對(duì)白花丹薄層鑒別的方法進(jìn)行了溫度、不同品牌薄層板等耐用性考察，發(fā)現(xiàn)供試品斑點(diǎn)色譜均與對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上顯相同顏色的譜斑點(diǎn)。

在對(duì)白花蛇舌草進(jìn)行薄層鑒別研究時(shí)，考察不不同展開(kāi)系統(tǒng)，首先對(duì)甲苯-丙酮-冰醋酸(10∶2∶0.2)展開(kāi)系統(tǒng)考察，發(fā)現(xiàn)供試品色譜中，有陰性干擾，之后調(diào)整為甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(8∶1.6∶0.2)，甲苯-乙酸乙酯-甲酸(20∶0.8∶0.5)，結(jié)果Rf值太大。調(diào)整三氯甲烷-丙酮(7∶1)展開(kāi)系統(tǒng)后，結(jié)果Rf值適中且無(wú)陰性干擾，故選擇三氯甲烷-丙酮(7∶1)為白花蛇舌草鑒別的展開(kāi)劑。我們對(duì)白花蛇舌草薄層鑒別的方法進(jìn)行了溫度、不同品牌薄層板等耐用性考察，發(fā)現(xiàn)供試品斑點(diǎn)色譜均與對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上顯相同顏色的譜斑點(diǎn)。

對(duì)處方中的馬齒莧也進(jìn)行了薄層鑒別研究，研究時(shí)發(fā)現(xiàn)馬齒莧薄層鑒別有陰性干預(yù)，嘗試多個(gè)展開(kāi)系統(tǒng)均未能排除干擾，故未列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。因方中的鬼針草缺乏對(duì)照藥品，未進(jìn)行薄層鑒別研究。

綜上所述，本研究建立了壯藥尖銳濕疣外洗劑中白花丹和白花蛇舌草的薄層鑒別，以及水溶性成分去乙酰車葉草酸甲酯的HPLC含量測(cè)定方法。其中乙酰車葉草酸甲酯含量測(cè)定方法經(jīng)驗(yàn)證，專屬性、精密度、重復(fù)性、準(zhǔn)確度和線性與范圍均符合相關(guān)要求，可用于壯藥尖銳濕疣外洗劑的質(zhì)量控制研究。