杜成志，趙 岑，呂 軍，王曉軍，吳倩倩，武恩斯，李巖杰，張?zhí)m迎

（聊城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東 聊城 252000）

桑黃（商品名） 一般包括銹革孔菌科（Hymenochaetaceae） 桑黃孔菌屬（Sanghuangporus） 真菌。近年，隨著粗毛纖孔菌（Inonotus hispidus） 等藥用菌藥理作用的深入研究，逐步將粗毛纖孔菌列為桑黃的1 個(gè)種[1]。粗毛纖孔菌原隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes） 銹革孔菌目（Hymenochaetales） 銹革孔菌科纖孔菌屬（Inonotus）[2]。其子實(shí)體一年生，單生或疊生，無菌柄，蓋形；鮮品無嗅無味，革質(zhì)至軟木栓質(zhì)，干后木栓質(zhì)[3]。粗毛纖孔菌子實(shí)體是我國傳統(tǒng)中藥材桑黃的重要來源，在東北地區(qū)主要用于治療消化不良等胃病[4-5]?，F(xiàn)有研究表明，桑黃所含的多糖、三萜類、酚類、黃酮類等生物活性物質(zhì)有明顯的藥理作用和臨床功效，主要用于治療各種癌癥、糖尿病、痛風(fēng)、關(guān)節(jié)炎等[6-7]。

聊城市臨清市黃河故道古桑園中擁有豐富的野生桑黃資源[8]。課題組經(jīng)野外采集、馴化，篩選出較適宜人工栽培的桑黃菌株，并通過篩選得到最佳菌株和最佳配方，試驗(yàn)結(jié)果可為實(shí)際生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試桑黃菌株L1 和L2，為聊城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院野外采集種，經(jīng)鑒定為粗毛纖孔菌Inonotus hispidus。

1.2 主要試劑

無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.4%），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；蒽酮（AR），上海麥克林生化科技股份有限公司；硫酸（AR）、無水乙醇（AR）、乙酸乙酯（AR）、香草醛（AR）、高氯酸（AR）、冰醋酸（AR），上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%），北京索萊寶科技有限公司；甲醇（AR），西隴科學(xué)股份有限公司。

1.3 主要儀器

JY1003 電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；DHG-9075A 鼓風(fēng)干燥箱，上海恒一科學(xué)儀器有限公司；TU-1901 紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HH-S6 恒溫水浴鍋，常州國宇儀器制造有限公司；ZNHW-150 智能調(diào)溫電加熱套，河南鞏義高科儀器有限公司；KH30R-Ⅱ高速冷凍離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；SY-360 超聲波清洗儀，上海寧商超聲儀器有限公司。

1.4 培養(yǎng)基配方

1.4.1 分離活化培養(yǎng)基配方

分離活化培養(yǎng)采用加富型PDA 培養(yǎng)基，含馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、 KH2PO23 g、MgSO41.5 g、麩皮10 g，水1 000 mL。

1.4.2 原種培養(yǎng)基配方

原種培養(yǎng)基配方為柞木屑72%、麩皮13%、玉米粉12%、紅糖1%、石膏1%、石灰1%。

1.4.3 栽培料配方

分別采用了2 個(gè)栽培料配方。配方C1 為桑木屑77%、麩皮10%、玉米粉10%、紅糖2%、石膏1%；配方C2 為桑木屑58%、棉籽殼20%、麩皮12%、玉米粉4%、豆粕3%、紅糖1%、石灰1%、石膏1%。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 菌種活化

將保藏菌種接種于加富型PDA 培養(yǎng)基上活化，經(jīng)二次轉(zhuǎn)接后備用。

1.5.2 原種制備

按照原種配方備料，主料于泡料桶中浸泡12～24 h 后，瀝水，與輔料一起混勻，靜置5～10 h 后再次翻料，培養(yǎng)料含水量為63%左右。將培養(yǎng)料裝入14 cm×27 cm×0.05 mm 的聚丙烯袋中進(jìn)行高壓滅菌。待菌袋冷卻后分別接入試驗(yàn)?zāi)阜N，放入發(fā)菌室內(nèi)進(jìn)行發(fā)菌培養(yǎng)。保持發(fā)菌室溫度為24 ℃，避光培養(yǎng)45 d，待菌絲滿袋后使用。

1.5.3 栽培種制備

將C1 和C2 兩種配方所需原料分別按比例混勻，預(yù)處理方法同1.5.2 所述?？刂圃耘嗔虾繛?3%左右，用18 cm×35 cm×0.05 mm 的聚丙烯袋裝袋，每袋濕質(zhì)量為1.3 kg。將菌袋進(jìn)行高壓滅菌，待冷卻后分別接入試驗(yàn)菌種，放入發(fā)菌室內(nèi)進(jìn)行發(fā)菌培養(yǎng)。保持發(fā)菌室溫度為24 ℃，避光培養(yǎng)55～60 d，待菌絲滿袋再后熟培養(yǎng)25 d 后使用。

1.5.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)計(jì)4 個(gè)處理，即L1C1、L1C2、L2C1、L2C2，每個(gè)處理3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)做7 袋，每個(gè)處理共21 袋。

1.5.5 出菇管理和采收

將菌包按隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)擺放在出菇棚內(nèi)地面上，保持棚內(nèi)溫度為23～28 ℃，避免陽光直射，打開風(fēng)口適當(dāng)通風(fēng)，在地面水溝適當(dāng)進(jìn)行灌水，保持空氣濕度為90%～95%。記錄原基形成時(shí)間；出菇后，觀察并記錄子實(shí)體生長情況。待子實(shí)體開始噴粉即為成熟，此時(shí)可以采收。試驗(yàn)共采收2 潮子實(shí)體并統(tǒng)計(jì)產(chǎn)量、生物學(xué)效率等。

1.6 桑黃有效成分檢測

1.6.1 粗多糖的檢測

1） 提取粗多糖。稱取桑黃樣品粉末2 g，置于圓底燒瓶中，加水60 mL，靜置1 h；加熱回流4 h，趁熱過濾；用少量熱水洗滌過濾器和濾渣；濾渣重復(fù)以上操作，合并濾液后水浴蒸干。蒸干后所得固體物質(zhì)先用5 mL 水溶解，之后邊攪拌邊滴加乙醇至75 mL，搖勻，在4 ℃條件下靜置12 h，離心后去上清液；沉淀用熱水溶解，隨后轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中；冷卻后加水定容，搖勻。取上述溶液適量，離心，精密量取3 mL 上清液于25 mL 容量瓶中加水定容，搖勻即得桑黃樣品粗多糖提取液。

2） 繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密稱取無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，加水配制質(zhì)量濃度為0.12 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精確量取上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、0.6、1.2、1.6、2.0 mL，分別置于10 mL 具塞試管中，加水至2.0 mL。迅速加入6 mL 硫酸蒽酮溶液，搖勻，靜置15 min，冰浴15 min 后取出。用紫外可見分光光度法，在625 nm 波長處分別測定標(biāo)準(zhǔn)品吸光度，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3） 測定粗多糖含量。精確量取上述1） 中得到的樣品粗多糖提取液2.0 mL，置于10 mL 具塞試管中，按照繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，在625 nm波長處測定樣品溶液吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出粗多糖含量。

1.6.2 三萜的檢測

1） 提取三萜。取桑黃樣品粉末2 g，置于具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL，超聲處理（功率140 W，頻率42 kHz） 45 min；冷卻后過濾至100 mL 容量瓶中；用適量甲醇分次洗滌過濾器和濾渣；濾液并入上述容量瓶中，加甲醇定容，搖勻即得桑黃樣品三萜提取液。

2） 繪制齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，加甲醇配制質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精確量取上述齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別置于15 mL具塞試管中；揮發(fā)干，置冷；精確加入新配制的香草醛冰醋酸溶液（精密稱取香草醛0.5 g，加入冰醋酸使其溶解，定容至10 mL 即得） 0.2 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻；70 ℃水浴加熱15 min，冰浴5 min后取出。精確加入乙酸乙酯4 mL，搖勻。用紫外可見分光光度法，在546 nm 波長處分別測定標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光度，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3） 測定三萜含量。精密量取桑黃樣品三萜提取液0.2 mL，置于15 mL 具塞試管中，按照繪制齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，在546 nm 波長處測定樣品吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出三萜的含量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 和SPSS 18 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，結(jié)果為3 次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理中桑黃子實(shí)體的生長時(shí)間

不同栽培料配方對不同野生桑黃子實(shí)體生長時(shí)間的影響情況詳見表1。

表1 不同處理中桑黃子實(shí)體的生長時(shí)間Tab.1 Fruit body growth time of Phellinus igniarius in different treatments

由表1 可以看出，4 個(gè)處理中原基形成時(shí)間相差不大，但是同一配方條件下，菌株L1 較菌株L2現(xiàn)原基時(shí)間和子實(shí)體成熟時(shí)間短，說明菌株L1 結(jié)實(shí)能力較菌株L2 強(qiáng)。對于同一菌株來說，配方C2 較配方C1 中桑黃子實(shí)體現(xiàn)原基時(shí)間和子實(shí)體成熟時(shí)間都短，說明配方C2 較配方C1 更適宜桑黃生長。吳亞召等[9]在研究中發(fā)現(xiàn)，在桑木屑中加入一定量的棉籽殼，對促進(jìn)桑黃菌絲生長及提高子實(shí)體產(chǎn)量有一定的促進(jìn)作用。本試驗(yàn)結(jié)果與其結(jié)論一致，可能是因?yàn)槊拮褮ぞ哂休^好的保水性，在出菇過程中能減少菌包內(nèi)的水分流失，并均衡栽培袋內(nèi)的營養(yǎng)，從而延長子實(shí)體生長時(shí)間。

2.2 不同處理中桑黃的生長特性

不同栽培料配方對不同野生桑黃生長特性的影響情況詳見表2。

表2 不同處理中野生桑黃的生長特性Tab.2 Growth characteristics of wild Phellinus igniarius in different treatments

由表2 可知，不同栽培料配方對桑黃子實(shí)體的生長特性及子實(shí)體形態(tài)有一定的影響。L1C2 處理中桑黃子實(shí)體各項(xiàng)指標(biāo)表現(xiàn)最優(yōu)，每袋平均產(chǎn)量達(dá)25.2 g（干質(zhì)量），且子實(shí)體形狀較好；平均生物學(xué)效率達(dá)30%；一潮菇出菇率最高，為100%。對同一菌株而言，配方C2 較配方C1 對桑黃子實(shí)體生長更有利；而在同一配方條件下，菌株L1 在一潮菇出菇率方面占有明顯的優(yōu)勢。子實(shí)體形態(tài)特征見圖1。

圖1 不同處理中桑黃子實(shí)體的形態(tài)Fig.1 Fruit body morphology of Phellinus igniarius in different treatments

2.3 不同處理中桑黃有效成分的含量

不同栽培料配方對不同野生桑黃有效成分含量的影響情況詳見表3。

表3 不同處理中野生桑黃有效成分的含量Tab.3 Content of active ingredients in wild Phellinus igniarius in different treatments

從表3 可以看出，L1C2 處理子實(shí)體中粗多糖含量最高，達(dá)2.05%；L1C1 處理桑黃子實(shí)體中粗多糖含量最低，為0.79%。L1C1 處理桑黃子實(shí)體中三萜含量最高，為2.71%；L2C1 處理桑黃子實(shí)體中三萜含量最低，為1.92%。比較2 個(gè)菌株子實(shí)體中三萜和粗多糖的含量，發(fā)現(xiàn)菌株L1 的三萜含量相對較高而粗多糖含量相對較低，L2 的粗多糖含量相對較高而三萜含量相對較低。說明菌株L2 和L1 在子實(shí)體形成過程中，代謝通路相差較大。比較2 個(gè)配方栽培的子實(shí)體，發(fā)現(xiàn)三萜含量差異不大，配方C2 栽培的子實(shí)體中粗多糖含量相對較高。說明配方C2 更有利于桑黃次級代謝產(chǎn)物的形成。

3 結(jié)論和討論

通過試驗(yàn)篩選出最佳桑黃菌株為L1，該菌株的優(yōu)勢主要表現(xiàn)在出菇率高，子實(shí)體中三萜含量高；最佳配方為C2（桑木屑58%、棉籽殼20%、麩皮12%、玉米粉4%、豆粕3%、紅糖1%、石灰1%、石膏1%），該配方條件下桑黃出菇率高、子實(shí)體中粗多糖含量高。L1C2 處理為本次試驗(yàn)的最佳處理，桑黃原基形成時(shí)間為6 d，子實(shí)體成熟時(shí)間為46 d，生長周期最短；每袋平均產(chǎn)量為25.2 g（干質(zhì)量）；生物學(xué)效率為30%；子實(shí)體中三萜含量為2.24%，粗多糖含量為2.05%；一潮菇出菇率達(dá)100%，二潮菇出菇率也最高，為66.7%，其他處理均未超過50%。

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同的野生桑黃菌株栽培特性差異較大，表現(xiàn)為部分菌株更適宜人工栽培，能耐受高氮源營養(yǎng)配方，子實(shí)體形態(tài)好、產(chǎn)量高，子實(shí)體中有效成分含量也較高；部分菌株則不適宜人工栽培，子實(shí)體形態(tài)差、產(chǎn)量低，子實(shí)體中有效成分含量低。不同的栽培料配方對桑黃生長特性具有一定的影響，在桑木屑配方中加入適量的棉籽殼有利于桑黃產(chǎn)量的提高，延長出菇期。