陳家興,楊志釗,崔永強(qiáng),劉震東,張秀磊,張曉

(1.河南大學(xué)人民醫(yī)院 肝膽胰腺外科,河南 鄭州 450003;2.鄭州大學(xué)人民醫(yī)院 肝膽胰腺外科,河南 鄭州 450003;3.河南省人民醫(yī)院 a.微生物實(shí)驗(yàn)室;b.肝膽胰腺外科,河南 鄭州 450003)

原發(fā)性肝癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一,其中肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)占75%～85%。HCC發(fā)病隱匿,進(jìn)展快,癌細(xì)胞極易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致HCC患者5 a生存率低[1]。傳統(tǒng)手術(shù)治療效果有限,而近些年出現(xiàn)的免疫治療、分子靶向治療等有待更多的臨床數(shù)據(jù)評(píng)估療效[2]。HCC有高度異質(zhì)性的發(fā)病特征,但無高特異性和高敏感性的診療靶點(diǎn),導(dǎo)致患者早期診斷率低及預(yù)后不佳[3-4],挖掘新穎分子生物標(biāo)志物,將有助于提高診斷的敏感性及研發(fā)高特異性的靶向藥物,改善目前HCC臨床診治的瓶頸問題。

熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)可協(xié)助維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,提高生物體對(duì)刺激的耐受,其可作為分子伴侶,參與細(xì)胞熱耐受、損傷修復(fù)等腫瘤發(fā)病的調(diào)控過程[5-6]。因此HSP既是癌癥發(fā)生和進(jìn)展過程的關(guān)鍵分子,同時(shí)也可作為抗癌藥物的作用靶點(diǎn)[7-8]。DNAJC7是HSP家族成員之一,主要通過協(xié)助完成蛋白的折疊、裝配、運(yùn)輸?shù)冗^程從而發(fā)揮分子伴侶的調(diào)控功能[9]。研究顯示DNAJC7中的致病變體導(dǎo)致肌萎縮側(cè)索硬化癥[10-11],多聚谷氨酸化修飾的DNAJC7蛋白可以作為腎細(xì)胞癌早期診斷的一種血清生物標(biāo)志物[12]。DNAJC7首次在肝臟方面的研究主要指其作為分子伴侶在小鼠肝臟Cyp2b10基因活化和脂肪變性的發(fā)展中起到了重要調(diào)控作用[13]。根據(jù)癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)中HCC的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和相對(duì)應(yīng)的臨床資料,本研究分析了DNAJC7在HCC中的表達(dá)水平、臨床預(yù)后關(guān)系以及潛在的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,進(jìn)一步驗(yàn)證其用于HCC早期篩查和預(yù)后監(jiān)測的可能。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

TCGA可提供基因組測序序列、表達(dá)情況、甲基化以及拷貝數(shù)變異數(shù)據(jù)等,有助于探索癌癥發(fā)病機(jī)制和挖掘關(guān)鍵的致病分子[14]。該研究在TCGA數(shù)據(jù)庫中共獲取到374例HCC患者的RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床相關(guān)信息,其中僅有50例患者具有瘤旁組織的信息。采用兩獨(dú)立樣本W(wǎng)ilcoxon檢驗(yàn)和配對(duì)分析法檢測這50例患者腫瘤組織與瘤旁組織中DNAJC7的表達(dá)量變化。隨后將374例HCC患者的RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行合并,剔除臨床信息不全的患者,最終357例HCC患者的樣本信息進(jìn)一步的預(yù)后相關(guān)分析和功能預(yù)測。

1.2 GO基因富集分析和KEGG基因富集分析

基因本體(gene ontology,GO)包含有大量基因參與的生物過程及所發(fā)揮的分子功能方面的信息。京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)系統(tǒng)地分析了基因產(chǎn)物的功能及在細(xì)胞中的代謝途徑,整合了代謝通路、藥物、疾病、基因序列及基因組等多方面的數(shù)據(jù)[15]。首先根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫中HCC患者的數(shù)據(jù)集,取中位值為分組標(biāo)準(zhǔn)將HCC患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,篩選出兩組間差異表達(dá)基因,logFC≥1且P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因項(xiàng)。本研究使用clusterPro-filer R語言包對(duì)DNAJC7進(jìn)行GO和KEGG注釋分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)均使用R軟件(v.3.6.1)進(jìn)行分析。以DNAJC7在HCC中的中位表達(dá)水平為分組標(biāo)準(zhǔn),將TCGA數(shù)據(jù)庫中獲得的HCC基因表達(dá)數(shù)據(jù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,使用Kaplan-Meier生存曲線和Cox回歸模型對(duì)HCC患者預(yù)后相關(guān)的臨床病理特征進(jìn)行分析。根據(jù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果進(jìn)一步繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線和曲線下面積(area under curve,AUC)。AUC為ROC曲線下與坐標(biāo)軸圍成的面積,AUC取值范圍0.5～1.0,越接近1.0,模型效果越好,以其評(píng)估DNAJC7對(duì)HCC患者臨床潛在預(yù)后價(jià)值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DNAJC7在HCC中的表達(dá)

基于TCGA數(shù)據(jù)庫中374例HCC患者腫瘤組織和50例瘤旁組織的數(shù)據(jù)分析,結(jié)果顯示DNAJC7在腫瘤組織中表達(dá)水平高于瘤旁組織(圖1A),且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)?？紤]到腫瘤組織數(shù)量多于瘤旁組織,這可能會(huì)引起統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果的偏差,進(jìn)一步行配對(duì)分析,結(jié)果提示DNAJC7在腫瘤組織中表達(dá)水平仍高于瘤旁組織(圖1B),且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)。

A圖為DNAJC7表達(dá)水平; B圖為配對(duì)后DNAJC7表達(dá)水平。

2.2 DNAJC7與HCC患者的臨床特征相關(guān)

單因素分析結(jié)果提示高表達(dá)的DNAJC7、腫瘤分期和T分期是HCC患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)性因素(P<0.05),見圖2A。為排除混雜因素干擾,進(jìn)行多因素分析,結(jié)果提示高表達(dá)的DNAJC7和T分期是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),見圖2B。

A圖為單因素分析;B圖為多因素分析。

2.3 高表達(dá)的DNAJC7對(duì)HCC患者預(yù)后的診斷價(jià)值

Kaplan-Meier生存分析結(jié)果提示,DNAJC7低表達(dá)組HCC患者總生存期(overall survival,OS)高于DNAJC7高表達(dá)組患者(P<0.05),見圖3。ROC曲線提示,1 a AUC值為0.707,3 a AUC值為0.635,5 a AUC為0.583,說明DNAJC7對(duì)HCC患者預(yù)后具有一定的診斷價(jià)值,見圖4。

圖3 DNAJC7表達(dá)與HCC患者預(yù)后的Kaplan-Meier生存分析圖

圖4 DNAJC7在HCC患者中的預(yù)后診斷價(jià)值

2.4 DNAJC7的GO分析及KEGG分析

GO分析提示DNAJC7可能參與了細(xì)胞黏附、RNA分解代謝、鈣黏蛋白結(jié)合等過程,并可能在其中發(fā)揮了重要的作用(圖5A)。KEGG分析結(jié)果表明DNAJC7可能通過多種信號(hào)通路參與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展,如細(xì)胞內(nèi)吞及氧化磷酸化等(圖5B)。即DNAJC7可能通過參與以上過程導(dǎo)致HCC的發(fā)生和進(jìn)展。

A圖為HCC中DNAJC7相關(guān)的GO生物學(xué)信號(hào)途徑;B圖為HCC中DNAJC7相關(guān)的KEGG生物學(xué)信號(hào)途徑。

3 討論

HCC起病隱匿,病死率高,手術(shù)切除是主要治療手段[1]。患者早期無特異癥狀,大多確診時(shí)即中晚期,需挖掘新的分子生物標(biāo)志物,研發(fā)靶向和免疫藥物,以提高治療效果[16]。HSP蛋白家族在腫瘤進(jìn)展中起重要作用,其有多重功能,如參與未折疊蛋白反應(yīng)、線粒體生物能量、凋亡、自噬、壞死、脂質(zhì)代謝、血管生成、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤免疫等,與多種腫瘤的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[17-18]。肝癌組織中HSPA12A、HSP90B1、HSPA4、HSPA5 和 HSPA6表達(dá)水平高于正常組織,且與早期肝癌患者的不良預(yù)后相關(guān)[19]。

DNAJ蛋白作為HSP家族成員之一,也與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。有研究報(bào)道DNAJA1通過miR-205-5p-EF1A1軸在HCC中高表達(dá),與HCC患者不良預(yù)后相關(guān)[20]。DNAJC5通過調(diào)節(jié)DNAJC5-SKP2-P27通路,可以促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖,這為HCC的診斷和治療提供了新的研究方向[21]。越來越多的DNAJ蛋白在HCC中的作用被揭曉,為繼續(xù)研究DNAJ蛋白在HCC中的作用提供了理論依據(jù)[22],然而DNAJC7在HCC中尚未有研究報(bào)道。研究表明多數(shù)癌癥與TP53基因突變有關(guān),30%～50%的HCC患者存在TP53基因突變[23]。TP53經(jīng)肝炎病毒誘導(dǎo)后發(fā)生突變,破壞MDM2-p53軸的穩(wěn)態(tài),進(jìn)而引起肝臟Kupffer細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的衰竭,導(dǎo)致肝細(xì)胞免疫微環(huán)境紊亂,促進(jìn)肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肝癌細(xì)胞[24]。鑒于p53是由最重要的抑癌基因TP53編碼,p53與DNA結(jié)合具有保護(hù)DNA完整性、修復(fù)損傷DNA、抑制損傷細(xì)胞的分裂并促其凋亡的功能,因此p53可通過阻止DNA突變或受損細(xì)胞分裂來抑制腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展[25]。目前已有的研究報(bào)道證實(shí),DNAJC7與p53在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的調(diào)控相關(guān),值得關(guān)注的是研究顯示DNAJC7的表達(dá)可以增強(qiáng)p53依賴的轉(zhuǎn)錄以及生長抑制活性,即其表達(dá)可以延長p53的半衰期[26]。當(dāng)DNAJC7表達(dá)時(shí),MDM2-p53軸功能障礙,導(dǎo)致p53-MDM2復(fù)合體的數(shù)量減少,提示DNAJC7使MDM2與p53解離,并參與p53-MDM2負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路,從而提高p53的穩(wěn)定性和活性。正是由于p53的抑癌特性,DNAJC7的表達(dá)可能與腫瘤抑制有關(guān)。不同的DNAJ蛋白在不同組織中的表達(dá)不同,其在腫瘤發(fā)展過程中的作用也不盡相同,既可能促進(jìn)腫瘤發(fā)生,也可能是腫瘤抑制因素。

本研究主要探索DNAJC7與HCC患者臨床病理特征相關(guān)性以及對(duì)患者生存預(yù)后的影響,進(jìn)而探索其可能影響HCC的分子機(jī)制。基于TCGA數(shù)據(jù)庫中HCC患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)DNAJC7在肝細(xì)胞癌組織中的mRNA表達(dá)量高于癌旁組織,表明DNAJC7可以作為HCC患者早期診斷的分子標(biāo)志物。結(jié)合HCC患者臨床病理特征,單因素與多因素Cox回歸分析結(jié)果提示,DNAJC7的表達(dá)水平和T分期是影響患者總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,提示DNAJC7可以成為HCC患者預(yù)后評(píng)估的新型分子標(biāo)志物。通過Kaplan-Meier曲線分析DNAJC7表達(dá)水平與HCC患者的臨床預(yù)后的相關(guān)性,結(jié)果顯示DNAJC7低表達(dá)患者的總生存期高于DNAJC7高表達(dá)患者。ROC分析結(jié)果顯示,患者1、3、5 a AUC分別為0.707、0.635、0.583,提示DNAJC7在預(yù)測HCC患者預(yù)后的方面具有一定的診斷價(jià)值。GO和KEGG分析結(jié)果表明DNAJC7可能參與了多種與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)的信號(hào)通路。以上研究結(jié)果表明,DNAJC7很可能參與了HCC細(xì)胞的生長,為后續(xù)在細(xì)胞水平上研究DNAJC7對(duì)HCC的影響提供了一定的基礎(chǔ)和方向。

4 結(jié)論

通過研究分析發(fā)現(xiàn)DNAJC7在HCC中表達(dá)上調(diào),并且高表達(dá)的DNAJC7是患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。DNAJC7可能是HCC患者新的預(yù)后監(jiān)測指標(biāo)和治療靶點(diǎn),可能將會(huì)作為新的分子標(biāo)志物為HCC患者提供更好的篩查及預(yù)后監(jiān)測指標(biāo),同時(shí)也為探究HCC發(fā)病的分子機(jī)制提供了新的研究方向。