劉瑞林,李紀(jì)高,杜明瑞,周全

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 風(fēng)濕病科,河南 鄭州 450000)

干燥綜合征(Sj?gren syndrome,SS)是一種系統(tǒng)性自身免疫性疾病。口干、眼干等外分泌腺損傷是SS的主要臨床表現(xiàn),伴或不伴肺纖維化、腎小管酸中毒以及周圍神經(jīng)病變等腺體外表現(xiàn)[1]。我國SS患病率為0.33%～0.77%[2],目前缺乏有效治療藥物,臨床主要以緩解口干、眼干局部癥狀為主,醫(yī)生和患者對(duì)療效的滿意度不高,藥物副作用多且花費(fèi)大[3]。研究表明,中藥具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗纖維化等作用,可有效緩解患者的局部癥狀,有助于SS患者全身癥狀改善[4-5]。中醫(yī)藥也成為了研發(fā)SS治療藥物的重要領(lǐng)域。

SS屬于中醫(yī)“燥痹”范疇,以陰虛津虧為本[6]。青蒿自古便是治療陰虛津傷的要藥?！妒?jì)總錄》載有“以青蒿一斤取汁熬膏,人參末、麥冬末各一兩,丸如梧桐子”,主治煩熱口干,《溫病條辨》《時(shí)病論》等也提及青蒿治療“邪伏陰分,傷陰劫液,發(fā)熱口渴之癥”,均與SS的主癥不謀而合。雙氫青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)是青蒿素的關(guān)鍵衍生物,具有抗病毒、抗炎、調(diào)節(jié)免疫以及抗纖維化等作用[7]。目前已有DHA治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等風(fēng)濕病的相關(guān)研究[8-9]。本研究首次將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)“多靶點(diǎn)-多通路”的分析優(yōu)勢(shì)與分子對(duì)接技術(shù)相結(jié)合[10-11],分析了DHA與SS在“藥物-靶點(diǎn)-疾病”間的潛在分子機(jī)制,以及藥物化合物與靶點(diǎn)通路的相互作用,對(duì)DHA治療SS的可能機(jī)制進(jìn)行了探討,以期為進(jìn)一步開展中醫(yī)藥治療SS的基礎(chǔ)和臨床研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件工具

從PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、Swiss平臺(tái)(http://swisstargetprediction.ch/)、PharMapper平臺(tái)(http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)、TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd/)、String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)、DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)、TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)、Venn Diagram平臺(tái)(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)中提取處理數(shù)據(jù)。使用Cytoscape 3.8.2、DAVID 6.8、Autodock 4.2.6、Auto Dock Vina 1.1.2、AutoDocktools 1.5.6、ChemBio3D Ultra 14.0、PyMoL 2.3.0以及Ligplotv 2.2.5等軟件工具分析。

1.2 研究方法

1.2.1DHA作用靶點(diǎn)篩選

從PubChem數(shù)據(jù)庫獲DHA的結(jié)構(gòu)式,導(dǎo)入Swiss平臺(tái),物種選擇“人類”。成分作用于靶點(diǎn)產(chǎn)生活性的概率>0為篩選條件,預(yù)測潛在活性成分的作用靶點(diǎn)。將DHA的結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Phar Mapper平臺(tái),靶點(diǎn)篩選條件設(shè)置為“Norm Fit>0.5”[12]。

1.2.2SS疾病靶點(diǎn)獲取

在GeneCards、OMIM和TTD數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵詞“Sj?gren syndrome、Sj?gren syndrome、primary Sjogren’s syndrome”進(jìn)行檢索,從而得到SS疾病靶點(diǎn)。將所有靶點(diǎn)整合在excle中,剔除重復(fù)基因,經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行校正。

1.2.3藥物-疾病核心靶點(diǎn)選取

將DHA作用靶點(diǎn)與SS靶點(diǎn)相互映射,作韋恩(Veen)圖,從而獲得交集基因。然后使用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建“DHA-SS靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.2.4靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

為進(jìn)一步研究藥物與疾病靶點(diǎn)蛋白之間的相互作用,將DHA-SS交集基因上傳至相互作用數(shù)據(jù)庫String構(gòu)建蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)。將結(jié)果文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析[13]。挑選核心的靶點(diǎn)做出PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.5GO功能富集和KEGG通路分析

將DHA-SS交集基因上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫,利用DAVID 6.8 GO基因功能從生物過程(biological process,BP)、細(xì)胞成分(cellular component,CC)以及分子功能(molecular function,MF)3方面注釋DHA治療SS的作用靶蛋白在基因功能中的作用。選取GO功能條目和KEGG通路條目(P<0.05),預(yù)測DHA治療SS的主要基因功能富集過程和信號(hào)通路[14]。

1.2.6分子對(duì)接驗(yàn)證

從TCMSP和PDB數(shù)據(jù)庫搜索化合物以及關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白,通過 AutoDock Vina軟件對(duì)DHA和SS關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接,驗(yàn)證其相互作用活性,并利用PyMOL 2.3.0和Ligplot 2.5.5軟件進(jìn)行相互作用模型分析。

2 結(jié)果

2.1 藥物-疾病作用靶點(diǎn)篩選與分析

首先篩選DHA作用靶點(diǎn),通過Swiss、PharMapper平臺(tái),分別獲得106和279個(gè)靶點(diǎn),合并數(shù)據(jù)剔除重復(fù)靶點(diǎn)后,共得到384個(gè)靶點(diǎn)。然后從GeneCards、OMIM和TTD數(shù)據(jù)庫,分別獲得1 075、623和10個(gè)與SS相關(guān)的靶點(diǎn),以GeneCards數(shù)據(jù)庫為準(zhǔn),合并數(shù)據(jù)剔除重復(fù)基因后,共得到1 685個(gè)靶點(diǎn)基因。將384個(gè)DHA作用靶點(diǎn)與1 685個(gè)SS靶點(diǎn)基因取交集,繪制Veen圖(圖1A),最終得到31個(gè)共同靶點(diǎn)(圖1B)。

A圖為DHA作用靶點(diǎn)與SS靶點(diǎn)基因Veen圖;B圖為DHA作用靶點(diǎn)與SS靶點(diǎn)基因的31個(gè)共同靶點(diǎn)。

2.2 DHA治療SS的PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將31個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2),以靶點(diǎn)大小和顏色深淺反映靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)度值,節(jié)點(diǎn)度值越大,表示該靶點(diǎn)與DHA治療SS機(jī)制的相關(guān)性越強(qiáng),以邊的粗細(xì)反映結(jié)合分?jǐn)?shù),對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觥＝Y(jié)果顯示,該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)中共有30個(gè)結(jié)點(diǎn)和166條相互關(guān)聯(lián)的邊,見表1。其中,表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、受體酪氨酸蛋白激酶-2(receptor tyrosine-protein kinase erbB-2,ERBB2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP9)、半胱天冬酶-1(caspase-1,CASP1)、半胱天冬酶-8(caspase-8,CASP8)、E3泛素-蛋白連接酶(E3 ubiquitin-protein ligase,MDM2)是DHA治療SS的關(guān)鍵靶點(diǎn),表明DHA治療SS可能是通過多個(gè)靶蛋白共同發(fā)揮作用的。

表1 核心靶點(diǎn)相關(guān)信息

圖2 DHA治療SS靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.3 GO功能富集分析

GO分析包括BP、CC、MF 3個(gè)方面,描述DHA治療SS的作用靶蛋白在基因功能中的作用。GO生物功能富集分析共篩選出137條GO條目,其中83條BP相關(guān),30條CC相關(guān),24條MF相關(guān)。最后以P<0.05作為標(biāo)準(zhǔn),根據(jù)P值從小到達(dá)排列,選取前10條GO條目,繪制 GO功能富集分析圖(見圖3)。GO分析結(jié)果顯示,DHA治療SS的生物過程主要涉及細(xì)胞凋亡、增殖的正調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)藥物的反應(yīng)、蛋白質(zhì)水解、細(xì)胞生長的正調(diào)控、細(xì)胞遷移的正調(diào)控、細(xì)胞表面受體信號(hào)通路、基因表達(dá)的正調(diào)控等;細(xì)胞成分主要涉及胞液、細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜、核、核漿、細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞外外體、線粒體、質(zhì)膜的整體部件等;分子功能相關(guān)的涉及蛋白結(jié)合、相同蛋白結(jié)合、鋅離子結(jié)合、三磷酸腺苷結(jié)合、內(nèi)肽酶活性、肽酶活性、蛋白激酶活性、酶結(jié)合、雙鏈DNA結(jié)合以及氧化還原酶活性等。

圖3 DHA治療SS的GO功能富集分析

2.4 KEGG通路富集分析

KEGG路通富集分析共得到68條與DHA治療SS相關(guān)的通路,根據(jù)P<0.05的數(shù)據(jù)從小到大排列,選取前15名DHA治療SS相關(guān)的通路,繪制KEGG氣泡圖(見圖4)。Y軸表示通路名稱,X軸表示富集度。氣泡越大所代表富集的基因越多,顏色越紅代表富集越顯著。結(jié)果表明,DHA可能通過調(diào)控Necroptosis通路(圖5)、Endocrine resistance通路(圖6)、IL-17通路、C-type lectin receptor 通路等治療SS。

圖4 DHA治療SS的KEGG通路富集分析

圖5 Necroptosis信號(hào)通路

圖6 Endocrine resistance信號(hào)通路

2.5 分子對(duì)接結(jié)果驗(yàn)證

為進(jìn)一步探索DHA與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系,選取CASP1、CASP8、ERBB2、EGFR和MMP9與DHA進(jìn)行半柔性分子對(duì)接,結(jié)合能值越小表示分子與靶蛋白結(jié)合性越高[15](見表2)。結(jié)果表明DHA與CASP1和CASP8的結(jié)合性最高,然后依次是ERBB2、EGFR和MMP9。分子對(duì)接的結(jié)果顯示,DHA與核心靶基因之間具有良好的結(jié)合能力(見圖7)。

表2 DHA與核心靶蛋白對(duì)接結(jié)果

圖7 分子對(duì)接示意圖

3 討論

SS的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,上皮細(xì)胞異常凋亡和免疫炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是SS外分泌腺功能受損的核心環(huán)節(jié)[16-17]。既往研究發(fā)現(xiàn)青蒿可以通過上調(diào)水通道蛋白5,增加SS模型鼠的唾液流量,減少小鼠飲水量[18]。部分青蒿素衍生物也被證實(shí)可以通過糾正Th1/Th2和Th17/Treg的免疫紊亂,抑制B細(xì)胞激活因子誘導(dǎo)的B細(xì)胞過度活化增殖,從而改善SS模型小鼠的外分泌腺的腺體損傷和炎癥浸潤,增加唾液量[19-20],這提示DHA作為青蒿素起效的主要成分在治療SS領(lǐng)域方面具有的巨大潛力。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析,篩選獲得了31個(gè)靶點(diǎn)基因作為DHA治療SS的潛在靶點(diǎn),包括EGFR、ERBB2、CASP1、CASP8和MMP9等12個(gè)核心靶點(diǎn)。KEGG富集分析則顯示,DHA可能主要通過細(xì)胞壞死性凋亡和內(nèi)分泌抵抗兩大機(jī)制途徑改善SS。其中EGFR和ERBB2屬于表皮生長因子家族,是表皮生長因子激活的關(guān)鍵,廣泛存在于外分泌腺上皮細(xì)胞[21]。與健康人對(duì)比,SS患者的唇腺活檢顯示唾液腺和腺泡導(dǎo)管中EGF/EGFR表達(dá)增加[22],EGF/EGFR信號(hào)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生大量細(xì)胞因子,促進(jìn)局部炎癥。Nakamura等[23]發(fā)現(xiàn),EGF在SS炎癥和細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)中均起著關(guān)鍵作用,不但介導(dǎo)了Fas通路引起的細(xì)胞凋亡,還抑制了TLR3誘導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)。多項(xiàng)研究也證實(shí),DHA可以通過下調(diào)EGFR和ADAM17相關(guān)信號(hào)通路,發(fā)揮治療作用[24-25]。結(jié)合分子對(duì)接結(jié)果,EGFR與DHA之間具有較好的結(jié)合活性,提示了DHA可能通過與EGFR競爭性結(jié)合,抑制EGF/EGFR通路的激活,從而增強(qiáng)EGF的抗炎抗凋亡作用。

為深入了解DHA治療SS的機(jī)制,本研究還通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)了137個(gè)潛在的DHA作用靶點(diǎn),涉及細(xì)胞的凋亡、增殖和信號(hào)傳導(dǎo)等眾多可能參與SS發(fā)病的生物學(xué)過程。CASP1作為細(xì)胞自噬的關(guān)鍵靶點(diǎn),影響細(xì)胞的凋亡增殖,其在SS患者的唾液中水平升高,大量活化的CASP1可以誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的成熟,導(dǎo)致炎癥反應(yīng),提示CASP1可能是治療SS的潛在靶點(diǎn)[26-27]。研究發(fā)現(xiàn)DHA可能通過促進(jìn)細(xì)胞自噬,抑制 IL-1β的產(chǎn)生,改善免疫環(huán)境下的炎癥反應(yīng)[28]。另一個(gè)核心靶點(diǎn)MMP9具有降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)的功能,其可能通過參與基底膜細(xì)胞基底層成分的降解,抑制腺體上皮細(xì)胞的修復(fù)再生,最終激活細(xì)胞凋亡,在一定程度上造成外分泌腺細(xì)胞損傷[29]。研究發(fā)現(xiàn)SS患者唾液腺中MMP9表達(dá)異常升高[30],提示高表達(dá)的MMP9可能通過促進(jìn)IFN-γ誘導(dǎo)產(chǎn)生CXCL10參與了SS的免疫炎癥反應(yīng)[31],DHA可能通過抑制MMP9的異常分泌,改善患者的炎癥反應(yīng)和腺體損傷。最后藥物與疾病靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了DHA與相關(guān)核心靶點(diǎn)之間擁有較好的分子結(jié)合活性,表明DHA分子可能通過與上述EGFR、CASP1、MMP9等核心靶點(diǎn)的有效結(jié)合,影響上皮細(xì)胞異常凋亡和免疫炎癥反應(yīng),發(fā)揮治療SS的作用。

此外,研究還發(fā)現(xiàn)通過青蒿琥酯聯(lián)合二甲雙胍干預(yù)2型糖尿病大鼠,模型鼠多飲多尿、胰島素抵抗和葡萄糖耐受不良等一系列糖尿病癥狀得到改善,且唾液腺損傷也明顯減輕[32],提示內(nèi)分泌抵抗可能在SS發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用。本研究也發(fā)現(xiàn)內(nèi)分泌抵抗通路是DHA治療SS的潛在信號(hào)通路之一?？v觀此次研究結(jié)果,除了壞死性凋亡和內(nèi)分泌抵抗機(jī)制兩大主要作用機(jī)制,DHA還可能通過白介素-17信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路等機(jī)制影響SS的疾病進(jìn)展。

4 小結(jié)

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù),分析了青蒿素關(guān)鍵衍生物DHA可能通過多靶點(diǎn)多通路途徑治療SS的潛在機(jī)制。結(jié)合文獻(xiàn)資料,提示DHA有望成為治療SS的有效藥物。但本研究是基于公共數(shù)據(jù)庫的預(yù)測分析,可能存在部分?jǐn)?shù)據(jù)的遺漏,后續(xù)研究仍需結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步驗(yàn)證DHA治療SS的具體機(jī)制。