田 唱, 郭 婉 萍, 陳 陽, 趙 晶, 陳 明

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034;2.大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 遼寧 大連 116600 )

0 引 言

?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-acyl-homoserine lactones,AHLs)是革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)系統(tǒng)(Quorum sensing,QS)中廣泛存在的一種信號分子,當(dāng)AHLs濃度超過一定閾值時,能夠與相應(yīng)的受體蛋白結(jié)合,進而調(diào)控多種生理功能,如毒力基因的表達、生物膜的形成等[1]。群體感應(yīng)淬滅酶能夠通過酶促反應(yīng)降解信號分子AHLs,保持信號分子濃度低于閾值,進而有效干擾細菌的QS系統(tǒng),抑制病原菌的致病性[2-3]。目前,已經(jīng)有很多群體感應(yīng)淬滅酶被分離鑒定,高絲氨酸內(nèi)酯酶和酰化酶是群體感應(yīng)淬滅酶中重要的兩類。群體感應(yīng)淬滅酶作為一種研究最多也是最有效的淬滅途徑,在克隆表達[4]、分離純化[5]、酶學(xué)性質(zhì)[6]、作用機理[7]、抗菌活性[8]、工業(yè)應(yīng)用[9]等方面研究成果豐富。AiiO酶于蒼白桿菌Ochrobactrumsp. A44中被發(fā)現(xiàn)[10],屬于AHL酰化酶中的α/β水解酶折疊酶系[4],能夠降解?；鶄?cè)鏈長度為4～14的AHLs及其相應(yīng)的3OH-Cx-HSLs[11]。國內(nèi)外對AiiO酶的相關(guān)報道比較少,高效表達AHL?；窤iiO有利于后續(xù)的病原菌防控制劑開發(fā)及其在致病菌中的應(yīng)用研究。目前,常規(guī)表達外源蛋白的方法是利用大腸桿菌表達系統(tǒng)和IPTG誘導(dǎo)的方式。但是,課題組前期采用這種方式誘導(dǎo)表達AiiO可溶性表達量很低,無法滿足后續(xù)研究的需要。

乳糖是乳糖操縱子的天然誘導(dǎo)劑,相較于常用的IPTG誘導(dǎo)劑昂貴的價格和潛在的毒性,在工業(yè)化生產(chǎn)中更加具有應(yīng)用前景。林曉栩等[12]利用乳糖誘導(dǎo)重組環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)表達,胞外酶活達19.87 U/mL。

本研究利用構(gòu)建的重組工程菌E.coliBL21(DE3)-pET-28a(+)-aiiO進行乳糖自誘導(dǎo)發(fā)酵,并對該發(fā)酵過程中誘導(dǎo)溫度、氮源濃度、乳糖添加時機和乳糖濃度等因素進行優(yōu)化,以期提高目的蛋白AiiO的表達量。

1 材料與方法

1.1 菌種及質(zhì)粒

小麥蒼白桿菌(Ochrobactrumtritici)、質(zhì)粒pET-28a,本實驗室保存;大腸桿菌E.coliDH5α、BL21(DE3),北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,酵母提取物5,氯化鈉10。

高密度增殖培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖5,磷酸氫二鈉3.55,磷酸二氫鉀3.40,氯化銨2.68,硫酸鈉0.71,七水合硫酸鎂0.50,檸檬酸三鈉0.30,六水合琥珀酸鈉2.50、三氯化鐵(0.1 mol/L) 1 mL。

復(fù)合自誘導(dǎo)培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨(T)10,酵母粉(Y)5,甘油26,乳糖2,磷酸氫二鈉3.56,磷酸二氫鉀3.40,氯化銨2.68,硫酸鈉0.71,七水合硫酸鎂0.50,葡萄糖0.50,檸檬酸三鈉0.30,六水合琥珀酸鈉5.40,三氯化鐵(0.1 mol/L) 1 mL。

1.3 重組表達載體pET-28a(+)-aiiO的構(gòu)建

根據(jù)GeneBank中公布AiiO蛋白的基因堿基序列,以及載體pET-28a(+)中的多克隆酶切位點,利用NCBI設(shè)計上下游引物,引物序列分別為F:5′-GGGAATTCCATATGATGAAATCCC ATGAAAT-3′(下劃線處為NdeI位點);R:5′-C GGAATTCTTAAGCCGTGCAGTC-3′(下劃線處為EcoRI位點)。提取O.tritici基因組,以此為模板擴增aiiO(810 bp),采用酶切酶連的方法將擴增產(chǎn)物與pET-28a載體連接。將連接產(chǎn)物化學(xué)轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞,挑取陽性重組子,對重組質(zhì)粒pET-28a(+)-aiiO進行雙酶切驗證。選取驗證正確的重組質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.4 重組蛋白AiiO的誘導(dǎo)表達及發(fā)酵條件優(yōu)化

將測序正確的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-aiiO轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3),接種于高密度增殖培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)中,37 ℃、180 r/min過夜活化后按照0.1%接種量轉(zhuǎn)接于復(fù)合自誘導(dǎo)培養(yǎng)基,37 ℃、250 r/min條件下培養(yǎng)。

采用單因素試驗依次對發(fā)酵過程中誘導(dǎo)溫度、氮源濃度、乳糖添加時機和乳糖濃度進行優(yōu)化,比較發(fā)酵過程中甘油消耗、菌體干重、AiiO表達量,確定最優(yōu)發(fā)酵條件。

1.5 重組蛋白AiiO的純化

收集菌液,4 ℃、6 000 r/min離心15 min,將收集的菌體懸浮于Tris-HCl緩沖液中進行超聲破碎,功率40%,工作2 s停3 s,共破碎40 s,再于4 ℃、13 000 r/min離心30 min,收集上清液。對收集的上清液進行親和層析純化、10 U/mg 凝血酶20 ℃水浴過夜酶切、凝膠過濾層析。

1.6 分析方法

1.6.1 甘油消耗量

取1 mL發(fā)酵液,6 000 r/min離心15 min,收集上清液,0.22 μm無菌濾膜過濾后的清液作為樣品,選用北京普利萊基因技術(shù)有限公司的甘油測定試劑盒對甘油質(zhì)量濃度進行測定。

1.6.2 菌體干重

取50 mL發(fā)酵液,4 ℃、6 000 r/min離心15 min,棄上清,沉淀用Tris-HCl緩沖液洗滌兩次,80 ℃烘干至質(zhì)量穩(wěn)定,記錄菌體干重。

1.6.3 目的蛋白AiiO含量

對細胞破碎液全蛋白和其離心后上清液進行SDS-PAGE檢測。以已純化且已知濃度的AiiO為標(biāo)準(zhǔn)上樣,利用Quantity One軟件對電泳圖進行分析,計算目的蛋白含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組表達載體及工程菌的構(gòu)建

將PCR擴增得到的目的基因aiiO(810 bp)切膠純化后,用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果如圖1(a)所示。在750～1 000 bp存在單一條帶,其大小與理論值相符,表明aiiO基因擴增成功。連接后的質(zhì)粒經(jīng)雙酶切電泳驗證,結(jié)果如圖1(b)所示,在5 369和810 bp附近各有一條酶切條帶,符合載體pET-28a(+)和目的基因aiiO的大小,初步判斷為陽性克隆,送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將測序正確的質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中,成功構(gòu)建重組工程菌E.coliBL21(DE3)-pET-28a(+)-aiiO。

(a) PCR擴增目的基因

2.2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1 誘導(dǎo)溫度

菌體轉(zhuǎn)接至復(fù)合自誘導(dǎo)培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)2～3 h,OD600在0.6～0.8,分別于20、25、30 ℃進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。由圖2(a)可知,在誘導(dǎo)溫度30 ℃時,0～8 h內(nèi)甘油消耗較快,誘導(dǎo)結(jié)束時菌體干重最大。但在30 ℃條件下,胞內(nèi)可溶性目的蛋白AiiO濃度極低,可能是因為菌體生長過快,導(dǎo)致包涵體的形成。20 ℃的低溫誘導(dǎo)條件下雖然有利于肽鏈的正確折疊,但由于菌體生長緩慢,最終胞內(nèi)可溶性AiiO濃度也較低。25 ℃培養(yǎng)菌體誘導(dǎo)產(chǎn)酶,胞內(nèi)可溶性目的蛋白AiiO產(chǎn)量最高,因此選擇25 ℃為最適誘導(dǎo)溫度。

(a) 誘導(dǎo)溫度

2.2.2 初始氮源質(zhì)量濃度

利用不同質(zhì)量濃度氮源(T 10 g/L+Y 5 g/L,T 15 g/L+Y 7.5 g/L,T 20 g/L+Y 10 g/L)的復(fù)合自誘導(dǎo)培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)菌體OD600為0.6～0.8,25 ℃進行誘導(dǎo),至OD600趨于穩(wěn)定。由圖2(b)可以看出,在氮源質(zhì)量濃度選擇T 20 g/L+Y 10 g/L時,菌體干重高于其他,同時甘油消耗量也最大。由表1可知,隨著氮源質(zhì)量濃度的增大,胞內(nèi)可溶蛋白AiiO產(chǎn)量隨之增加,在T 20 g/L+Y 10 g/L條件下,胞內(nèi)可溶性AiiO產(chǎn)量最高,達到276.04 mg/L。因此,選取T 20 g/L+Y 10 g/L為最適氮源質(zhì)量濃度。

表1 不同條件下發(fā)酵產(chǎn)AiiO蛋白結(jié)果

2.2.3 添加乳糖誘導(dǎo)時機

選擇T 20 g/L+Y 10 g/L復(fù)合自誘導(dǎo)培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)菌體OD600為0.6～0.8,25 ℃繼續(xù)培養(yǎng),分別在發(fā)酵初始、對數(shù)前期(6 h)、對數(shù)中期(8 h)添加2 g/L乳糖誘導(dǎo)產(chǎn)AiiO。由圖2(c)和表1可知,在菌體生長的對數(shù)中期添加乳糖,基本不能起到誘導(dǎo)作用;在對數(shù)前期添加乳糖,雖然在細胞破碎后的全蛋白中檢測到較高濃度的AiiO,但胞內(nèi)可溶性AiiO濃度很低。在發(fā)酵初始添加乳糖,胞內(nèi)可溶性AiiO產(chǎn)量最高,說明乳糖最佳添加時機為發(fā)酵初始時。

2.2.4 乳糖添加量

在氮源選擇T 20 g/L+Y 10 g/L、發(fā)酵初始添加誘導(dǎo)物乳糖、誘導(dǎo)溫度25 ℃的優(yōu)化條件下,考察不同乳糖添加量(2.0、5.0、7.5、10.0 g/L)對重組菌株發(fā)酵產(chǎn)目的蛋白AiiO的影響,結(jié)果見圖2(d)和表1?？梢钥闯?不同的乳糖添加量對重組菌株E.coliBL21(DE3)-pET-28a(+)-aiiO甘油消耗和菌體細胞生長的影響較小,4種乳糖添加量下甘油消耗和菌體干重變化趨勢基本一致,說明重組菌株優(yōu)先利用復(fù)合自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中甘油、蛋白胨和酵母粉等碳氮源,乳糖作為一種不易被利用的碳源,其添加量多少對甘油消耗及菌體細胞生長基本沒有影響。由表1可見,4種乳糖添加量下,細胞內(nèi)可溶性目的蛋白AiiO(上清)產(chǎn)量表現(xiàn)出較大差異,乳糖添加量為5 g/L時,胞內(nèi)可溶性AiiO產(chǎn)量最高,達到374.26 mg/L,明顯高于其他3種。因此,選取誘導(dǎo)物乳糖的適宜添加量為5 g/L。

3 結(jié) 論

以常規(guī)誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)重組菌株E.coliBL21(DE3)-pET-28a(+)-aiiO產(chǎn)AiiO蛋白,可溶性表達量極低。采用乳糖代替 IPTG為誘導(dǎo)劑,從誘導(dǎo)溫度、氮源濃度、乳糖添加時機和乳糖添加量等4個方面進行優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),相較于IPTG,以乳糖為誘導(dǎo)劑顯著提高了AiiO蛋白的可溶性表達,在誘導(dǎo)溫度25 ℃、氮源為20 g/L蛋白胨和10 g/L酵母粉、發(fā)酵初始添加5 g/L乳糖條件下,胞內(nèi)可溶性目的蛋白AiiO產(chǎn)量達到374.26 mg/L,占胞內(nèi)總目的蛋白的52.72%。