孫 林, 宋 宛 霖, 鐘 志 海, 劉 正 一

( 1.中國科學(xué)院 煙臺海岸帶研究所, 山東 煙臺 264003;2.中國科學(xué)院 海洋大科學(xué)研究中心, 山東 青島 266071 )

0 引 言

海藻是一類低等水生孢子植物,富含海藻多糖[1]。海藻多糖就來源可分為褐藻多糖、紅藻多糖和綠藻多糖三大類,具有多種生物活性[2-3]。海藻多糖分子質(zhì)量較大、溶解度低、生物利用度低,因此在醫(yī)學(xué)、材料等方面的利用效率也較低,在應(yīng)用方面受到很大限制[4]。

海藻寡糖是來自海藻細(xì)胞壁中海藻多糖的降解產(chǎn)物[5],是聚合度在2～10的直鏈或支鏈化合物。海藻寡糖的組成各不相同,例如瓊膠寡糖由瓊二糖為重復(fù)單位連接而成;褐藻膠寡糖由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸通過β-1,4-糖苷鍵連接而成[6]。相較于海藻多糖,海藻寡糖具有溶解度高、分子質(zhì)量低的特點(diǎn),分子質(zhì)量通常小于2 000 u。海藻寡糖具有多種生物活性,如保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)[7]、抗氧化[8]、促生長[9-11]、誘導(dǎo)植物抗逆性[12-13]、產(chǎn)品保鮮[14-15]等,在農(nóng)業(yè)[16-18]、醫(yī)藥[19-20]、食品[21]、化工[22]等領(lǐng)域具有獨(dú)特的應(yīng)用優(yōu)勢。對海藻寡糖的深度開發(fā)利用已成為當(dāng)前海洋生物資源高值化應(yīng)用的重要發(fā)展趨勢[6](圖1)。例如,當(dāng)前海藻寡糖的高純標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)量低且價(jià)格高昂,每10 mg售價(jià)高達(dá)數(shù)百美元。如何降低生產(chǎn)成本,突破生產(chǎn)工藝,實(shí)現(xiàn)大規(guī)模制備高純寡糖是目前海藻寡糖產(chǎn)業(yè)化研究的重點(diǎn)。

圖1 海藻寡糖的應(yīng)用

海藻寡糖因其優(yōu)良的生物學(xué)活性受到越來越多的關(guān)注,但當(dāng)前海藻多糖的降解制備工藝仍有較多局限性、成本較高等缺點(diǎn),限制了寡糖的生產(chǎn)效率。深入研究開發(fā)新的制備工藝對于高值化、高質(zhì)化利用海藻多糖為代表的海洋生物資源具有重要意義[23]。常用的海藻寡糖制備方法(表1)主要包括物理制備法、化學(xué)制備法和酶制備法[24]。物理制備法存在反應(yīng)機(jī)理不明確、重復(fù)性不高,酶制備法存在成本較高、效率較低等不足[25],而化學(xué)法的效率高且成本低,因此是目前最成熟的海藻寡糖產(chǎn)業(yè)化模式。

表1 海藻寡糖3種制備方法的比較

海藻寡糖的種類有多種,其中,褐藻膠寡糖(Alginate oligosaccharides,AOS)、巖藻寡糖(Fucoidan oligosaccharides,FOS)、瓊膠寡糖(Agar oligosaccharides,AGOS)、卡拉膠寡糖(Carrag-eenan oligosaccharides,COS)和滸苔寡糖(Enteromorpha oligosaccharides,EOS)等5種寡糖是褐藻、紅藻、綠藻等海藻寡糖的主要組成部分。本文論述這5種代表性的海藻寡糖的化學(xué)法制備技術(shù),以此介紹海藻寡糖的化學(xué)法制備技術(shù)共性和特殊點(diǎn)。

1 褐藻膠寡糖(AOS)

褐藻膠寡糖是褐藻膠的降解產(chǎn)物,具有溶解性好、分子質(zhì)量小、穩(wěn)定性強(qiáng)、易被機(jī)體吸收且安全性高等特點(diǎn)[25]?；瘜W(xué)法制備褐藻膠寡糖包括光化學(xué)法、水熱法、亞臨界熱解法、酸水解法、堿水解法、氧化還原法和有機(jī)合成法等方法(表2)。

表2 褐藻膠寡糖的化學(xué)制備法

表2所列方法中,光化學(xué)降解通過隨機(jī)破壞褐藻酸鈉的糖苷鍵進(jìn)行;水熱法降解則是先釋放甘露糖醛酸(M),選擇性斷裂M-M糖苷鍵;亞臨界熱解法中,海藻酸鹽中的鍵通過β-消除反應(yīng)選擇性地?cái)嗔?隨著進(jìn)一步水熱分解,單體亞基中的C—C或C—O鍵斷裂。氧化還原法降解機(jī)理:糖苷氧化產(chǎn)生共軛酸質(zhì)子,共軛酸形成的非還原末端與碳-氧钅翁離子發(fā)生斷裂,水分子加入碳-氧钅翁離子中形成還原末端,最終形成由G、M單糖構(gòu)成的聚合度不等的寡糖[28]。

最常用的褐藻膠寡糖生產(chǎn)方法是酸水解法,使用的酸包括鹽酸、草酸、甲酸和硫酸等[28]。由于海藻酸鹽的耐酸性,海藻酸鹽不能被無機(jī)酸完全降解。用多種酸綜合水解海藻酸鹽,與傳統(tǒng)的酸水解法相比具有清潔、快速、產(chǎn)物產(chǎn)率高等特點(diǎn)。此外,還可以應(yīng)用合成子組裝從非還原端到還原端的糖鏈,以較高的選擇性制備G-連接的寡糖,但反應(yīng)需要多重的基團(tuán)保護(hù)、去保護(hù)步驟,且只能合成聚合度小的寡糖,產(chǎn)量低[29]。

化學(xué)降解制備法所用化學(xué)試劑反應(yīng)較劇烈,因此得到的產(chǎn)物都有活性較低的缺點(diǎn)。物理法與酶法制備得到的產(chǎn)物活性相對更高,但反應(yīng)效率較低且成本較高。

實(shí)際生產(chǎn)的過程中通常采用多種方法結(jié)合應(yīng)用,以提高生產(chǎn)效率和生產(chǎn)質(zhì)量。例如,通過γ射線、H2O2、電離輻射和H2O2的組合處理,可以得到多種分子質(zhì)量不同的低聚糖。相對于僅通過γ射線產(chǎn)生的低聚糖,這一方法將所需的射線劑量減少了90%[30]。在褐藻膠寡糖的生產(chǎn)中可以多種方法結(jié)合使用,以達(dá)到取長補(bǔ)短、提質(zhì)增效的效果。

2 巖藻寡糖(FOS)

巖藻多糖多存在于褐藻中,是一種結(jié)合有硫酸基團(tuán)的水溶性多糖,主要由巖藻吡喃環(huán)以α-1,3-糖苷鍵連接而成,同時(shí)夾雜著木糖、半乳糖、葡萄糖醛酸等糖類[31]。與巖藻多糖相比,巖藻寡糖因水溶性好、易被機(jī)體吸收利用、具有多種生物活性等優(yōu)點(diǎn),近年來更受人關(guān)注。

表3所列方法中,H2O2在氧化反應(yīng)體系中產(chǎn)生羥自由基,羥自由基使巖藻多糖發(fā)生分子內(nèi)的重排,進(jìn)而斷裂β-1,4-糖苷鍵,產(chǎn)生分子質(zhì)量較小的低聚糖。酸水解法等的原理為采用酸性物質(zhì)斷裂糖苷鍵進(jìn)而產(chǎn)生分子質(zhì)量較小的低聚糖。此外,還有物理法和酶法降解。物理法降解包括超聲波降解法或γ射線輻照制備巖藻寡糖。海洋軟體動物大菱鲆消化腺中的一種蛋白提取物也可從巖藻聚糖中釋放L-巖藻糖,并降低多糖的分子大小[34]。物理法與酶法制備得到的產(chǎn)物在活性方面均優(yōu)于化學(xué)法制備得到的產(chǎn)物,但也有成本高效率低等缺點(diǎn)。

表3 巖藻寡糖的化學(xué)制備法

3 瓊膠寡糖(AGOS)

瓊膠是海洋中含量豐富的一類多糖,在制備生物材料等方面應(yīng)用廣泛。但它由于有類似于褐藻多糖的分子質(zhì)量大等特點(diǎn),在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用受到很大限制。然而,瓊膠寡糖的分子質(zhì)量相對較小,有著易降解吸收等優(yōu)點(diǎn)。瓊膠寡糖的聚合度一般為2～10,制備方法包括化學(xué)降解法和酶降解法,降解產(chǎn)物包括瓊寡糖和新瓊寡糖[35]。裂解瓊膠的α-1,3-糖苷鍵,生成以β-D-半乳糖為非還原性末端和以3,6-內(nèi)醚-α-L-半乳糖為還原性末端的瓊寡糖;裂解瓊膠的β-1,4-糖苷鍵,生成以β-D-半乳糖為還原性末端和以3,6-內(nèi)醚-α-L-半乳糖為非還原性末端的新瓊寡糖。

表4 瓊膠寡糖的化學(xué)制備法

酸降解法應(yīng)用最為廣泛,普遍采用的是濃度較稀的鹽酸、硫酸、檸檬酸等降解制備瓊膠寡糖。降解時(shí)通常采用直接加酸降解、逐級加酸降解、非均相降解等方法。

酶法制備瓊膠寡糖具有反應(yīng)效率高、產(chǎn)物專一性好、反應(yīng)條件溫和易控制、無污染等諸多優(yōu)勢,同時(shí)酶法制備得到的產(chǎn)物活性比化學(xué)法更高。但是酶制劑分離困難、產(chǎn)量有限、成本高,因而使酶法制備無法大規(guī)模應(yīng)用于生產(chǎn)。

4 卡拉膠寡糖(COS)

卡拉膠主要來源于紅藻的細(xì)胞壁,應(yīng)用較廣泛,但同時(shí)有分子質(zhì)量大、黏度大、空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜等特點(diǎn),進(jìn)而影響其生物活性。根據(jù)半乳糖中是否含有內(nèi)醚以及半乳糖上硫酸基的數(shù)量和連接位置不同分為κ-、ι-和λ-型卡拉膠,對應(yīng)的卡拉膠寡糖也包括κ-、ι-和λ-型卡拉膠寡糖?？ɡz寡糖是卡拉膠降解后的產(chǎn)物,分子質(zhì)量較小,具有溶解度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn),同時(shí)安全性較高。

表5所列方法中,甲醇鹽酸法對卡拉膠進(jìn)行水解,可以降解卡拉膠的半乳糖苷鍵和3,6-脫水半乳糖苷鍵;無機(jī)酸可以斷裂卡拉膠分子長鏈中的糖苷鍵,兩種方法均為斷裂單元間糖苷鍵制備卡拉膠寡糖。

表5 卡拉膠寡糖的化學(xué)制備法

物理降解法也可以制備卡拉膠寡糖,但反應(yīng)過程和反應(yīng)得到的產(chǎn)物較難控制,同時(shí)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)容易被破壞。酶降解法有反應(yīng)專一性好、條件溫和、底物專一等優(yōu)點(diǎn),但成本高且難以擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模?？ɡz酶都是內(nèi)切酶,能夠切割卡拉膠的內(nèi)部β-1,4-糖苷鍵并產(chǎn)生一系列偶數(shù)的寡糖[41]。酶降解法由于可以使多糖按規(guī)律降解制備為寡糖,反應(yīng)溫和,因此酶降解法制備得到的產(chǎn)物活性優(yōu)于物理降解法和化學(xué)降解法。

5 滸苔寡糖(EOS)

滸苔是我國沿海地區(qū)常見的一種大型綠藻[42]。近年來,我國黃海海域連年爆發(fā)由滸苔構(gòu)成的綠潮,生物量高達(dá)千萬噸[43],對海洋生物生存、海洋運(yùn)輸構(gòu)成嚴(yán)重影響,因此對滸苔資源進(jìn)行規(guī)?；_發(fā)利用具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會價(jià)值。滸苔多糖主要由鼠李糖、木糖、葡萄糖等單糖組成,富含糖醛酸和硫酸基,主鏈中各單糖間有多種鏈接鍵型[44]。滸苔寡糖是滸苔多糖降解后的產(chǎn)物,相對于滸苔多糖具有更好的溶解性和更顯著的降血脂、抗病毒等功效[45]。

滸苔寡糖的降解制備(表6)中,酸解法是最常用的方法,但在降解過程中易發(fā)生硫酸基團(tuán)脫落的現(xiàn)象。氧化降解法可減少硫酸基團(tuán)脫落,但產(chǎn)物組成復(fù)雜且分離純化困難[48]。酶解法反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng),但反應(yīng)過程中易形成不飽和鍵,且酶的制備選擇較困難[49]。因此制備時(shí)可以將化學(xué)法與酶法相結(jié)合制備,以達(dá)到提質(zhì)增效的目的。

表6 滸苔寡糖的化學(xué)制備法

6 結(jié)論與展望

化學(xué)法降解制備工藝是目前規(guī)模最大的海藻寡糖制備方法,也是當(dāng)前最成熟的產(chǎn)業(yè)化模式。但是幾種海藻寡糖的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展和研究進(jìn)展不同,褐藻寡糖和紅藻寡糖的研究和制備規(guī)模較大,綠藻寡糖的研究較少,但同樣面臨產(chǎn)物活性低和難以實(shí)現(xiàn)清潔化生產(chǎn)的問題。酸法或氧化法降解制備寡糖有反應(yīng)快速、效率高的優(yōu)點(diǎn),但同時(shí)也有反應(yīng)過于劇烈、較難控制、寡糖活性較低等缺點(diǎn)。推測將物理法或酶法與化學(xué)法相結(jié)合是制備工藝發(fā)展的趨勢之一,可以此保證產(chǎn)物的聚合度和活性,達(dá)到精準(zhǔn)化制備的目的,同時(shí)減少環(huán)境污染問題。當(dāng)前海藻寡糖的高純產(chǎn)品,如標(biāo)準(zhǔn)品市場的產(chǎn)量低且價(jià)格高昂,因此高純度、單一聚合度的寡糖具有廣闊的市場前景。

在應(yīng)用方面,由于化學(xué)法制備得到的寡糖聚合度范圍較大,因此可以將其運(yùn)用到農(nóng)肥、飼料和水產(chǎn)餌料等對聚合度要求不高的應(yīng)用領(lǐng)域,拓展應(yīng)用范圍,提高應(yīng)用效率,更好地服務(wù)于生態(tài)農(nóng)業(yè)和生態(tài)養(yǎng)殖業(yè)的提質(zhì)增效。我國化肥使用量巨大,占世界10%的耕地消耗了全球30%的化肥。由于海藻肥中的海藻寡糖等活性成分具有提質(zhì)增效的效果,可以實(shí)現(xiàn)化肥的增效減施,因此海藻肥的應(yīng)用具有很大的市場前景。根據(jù)國家統(tǒng)計(jì)局查詢的數(shù)據(jù)顯示,我國農(nóng)用化肥施用折純量在近十年呈現(xiàn)出先增長后降低的趨勢,分析原因?yàn)?015年農(nóng)業(yè)部制定了《到2020年化肥使用量零增長行動方案》,此方案促進(jìn)了化肥的減施,取得了明顯成效。但當(dāng)前化肥施用量仍然巨大,在化肥減施方面還有較大發(fā)展空間。在之后的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,推廣使用海藻肥逐漸替代化肥,將是促進(jìn)減少化肥用量,同時(shí)保證農(nóng)作物產(chǎn)量的有效途徑。