王麗娟，路穎，韓燕聰，劉妮妮

抗雙鏈DNA IgG 抗體（Anti-dsDNA IgG）是系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus， SLE）的特異性抗體，存在于SLE 患者的血清中。相關(guān)研究指出該抗體的滴度與SLE的活動(dòng)性存在相關(guān)性，并與狼瘡性腎小球腎炎的發(fā)病密切相關(guān)［1-4］。美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（American College of Rheumatology，ACR）已將Anti-dsDNA IgG 陽性作為SLE 患者的重要診斷標(biāo)準(zhǔn)之一［5-6］。大量實(shí)踐表明，Anti-dsDNA IgG 檢測對于SLE 患者的早期診斷和治療具有重要意義［7-8］。目前臨床實(shí)驗(yàn)室檢測Anti-dsDNA IgG 的方法主要有間接免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附法、免疫印跡法、放射免疫法和化學(xué)發(fā)光免疫分析法等。其中化學(xué)發(fā)光免疫分析法操作簡便、無放射性、檢測速度快、靈敏度高等，近幾年與該類檢測相關(guān)的設(shè)備得到較快發(fā)展［9-10］。本研究主要參考美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI）的系列標(biāo)準(zhǔn)文件、中國合格評定國家認(rèn)可委員會(huì)（China National Accreditation Service for Conformity Assessment， CNAS）的相關(guān)應(yīng)用說明和指南，以及Anti-dsDNA IgG 測定試劑盒說明書，對Maglumi2000 P 檢測系統(tǒng)檢測Anti-dsDNA IgG 的性能進(jìn)行驗(yàn)證，以明確其是否滿足實(shí)驗(yàn)室用途和臨床需求，為SLE 患者尋求Anti-dsDNA IgG 定量檢測的可靠方法。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2021 年4-6 月海軍第九七一醫(yī)院開展Anti-ds-DNA IgG 檢測的血清樣本66 份，2019-2020 年國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心的Anti-dsDNA 室間質(zhì)評標(biāo)本共20 份，以及健康體檢正常血清標(biāo)本20 份。

1.2 儀器和試劑

本研究采用的儀器和試劑為深圳新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司的Maglumi2000 P 檢測系統(tǒng)，配套Anti-ds-DNA IgG 測定試劑盒（批號：129210111）、校準(zhǔn)品（批號：129210111）和質(zhì)控品（批號：129210111）。

1.3 方法

1.3.1 精密度驗(yàn)證 參照CLSI 的EF15-A2 方案［11］，采用高、低2 個(gè)水平的質(zhì)控品（一個(gè)生理水平，一個(gè)病理水平）進(jìn)行精密度驗(yàn)證；在檢測系統(tǒng)處于優(yōu)良的條件下，2 組質(zhì)控品分別分裝5 管，2～8 ℃冷藏保存。每天取1 管上機(jī)連續(xù)檢測3 次，連續(xù)5 d，計(jì)算平均值及變異系數(shù)CV，得到中間精密度及重復(fù)性精密度。最后與廠家聲明的精密度進(jìn)行比較，低于廠家說明書聲稱的數(shù)值，則驗(yàn)證通過。

1.3.2 準(zhǔn)確度驗(yàn)證 （1）回收率實(shí)驗(yàn)：參照CLSI 的EF9-A2方案［11］，選擇合適濃度的低值檢測樣本，其中取1 份900 μl低值檢測樣本加入已知濃度為800 IU/ml 的校準(zhǔn)品100 μl制成回收分析樣本。在另一份同等濃度900 μl 低值檢測樣本中加入100 μl 無待測分析物的校準(zhǔn)品S0，制成基礎(chǔ)樣本。每個(gè)樣本檢測3 次，計(jì)算均值濃度，按如下公式計(jì)算回收率：

式中，R為回收率，V為加入的校準(zhǔn)品體積，V0為低值檢測樣本的體積，C為回收分析樣本的濃度均值，C0為基礎(chǔ)樣本的濃度均值，Cs 為校準(zhǔn)品的濃度。

廠家聲稱的數(shù)值在90%～110%范圍內(nèi)。

（2）符合率驗(yàn)證（每個(gè)樣本重復(fù)檢測不少于3 次）：與國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心的Anti-dsDNA IgG 質(zhì)評物進(jìn)行比對，20 份標(biāo)本中，有19 份及以上符合，則驗(yàn)證通過。

1.3.3 檢出限驗(yàn)證 采用S0校準(zhǔn)品重復(fù)測定20 次，計(jì)算平均值（M）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），得出M+2SD，代入工作曲線，求出相應(yīng)的濃度值，即為檢出限。

1.3.4 線性范圍驗(yàn)證 選取高濃度（800 IU/ml）和低濃度（0.5 IU/ml）的定值校準(zhǔn)品，將高濃度（H）與低濃度（L）樣本按預(yù)定比例稀釋，稀釋后的濃度覆蓋試劑說明書給定的線性范圍，按5L，4L+H，3L+2H，2L+3H，L+4H，5H 的比例配制成6 個(gè)系列濃度樣本，以200 μl 為一個(gè)單位，每個(gè)濃度水平的樣本量為1.00 ml，每個(gè)樣本重復(fù)檢測3 次，取其平均值。以理論值為橫坐標(biāo)（X），以檢測均值為縱坐標(biāo)（Y），擬合一次曲線Y=a+bX，進(jìn)行回歸分析，求相關(guān)系數(shù)r2。0.95≤r2≤1.05 被認(rèn)為線性良好。

1.3.5 生物參考區(qū)間驗(yàn)證 選取20 份體檢健康者（體檢報(bào)告診斷無異常者）新鮮血清，其中男10 例，年齡18～89 歲，女10 例，年齡18～88 歲。將20 份標(biāo)本的檢測結(jié)果與廠家提供的生物參考區(qū)間進(jìn)行比對，不超過1 例的測定值落在廠家提供的參考區(qū)間之外，則驗(yàn)證通過。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究基礎(chǔ)數(shù)據(jù)由Maglumi2000 P 檢測系統(tǒng)生成，連續(xù)變量符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用±s表示。采用Microsoft Office Excel 2016 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算相關(guān)系數(shù)、擬合回歸方程。

2 結(jié)果

2.1 精密度驗(yàn)證結(jié)果

Anti-dsDNA IgG 高、低水平的重復(fù)性精密度CV＜8%，中間精密度CV＜15%。見表1。均在廠家說明書聲稱的可接受范圍內(nèi)，表明精密度驗(yàn)證通過。

表1 抗雙鏈DNA IgG 精密度實(shí)驗(yàn)

2.2 準(zhǔn)確度驗(yàn)證結(jié)果

（1）通過3 次實(shí)驗(yàn)檢測，計(jì)算均值得出回收率為94.09%，在90%～110%范圍內(nèi)，表明回收率實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證通過。見表2。

表2 抗雙鏈DNA IgG 回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果（IU/ml）

（2）通過和國家衛(wèi)健委室間質(zhì)評物比對，符合率為100%，表明符合率驗(yàn)證通過。見表3。

表3 抗雙鏈DNA IgG 符合率驗(yàn)證結(jié)果（IU/ml）

可見，回收率和符合率均符合廠家提供的標(biāo)準(zhǔn)，表明準(zhǔn)確度驗(yàn)證通過。

2.3 檢出限驗(yàn)證結(jié)果

計(jì)算結(jié)果顯示，檢出限結(jié)果為0.443 IU/ml，＜0.500 IU/ml表示檢出限驗(yàn)證通過。見表4。

表4 抗雙鏈DNA IgG 檢出限驗(yàn)證結(jié)果（IU/ml）

2.4 線性范圍驗(yàn)證結(jié)果

高、低濃度校準(zhǔn)品混合后的檢測均值和理論值見表5，相應(yīng)的散點(diǎn)圖見圖1。擬合的一次曲線為Y=0.980X-2.610，相關(guān)系數(shù)r2=0.998，b=-2.610＜0.970，均在范圍內(nèi)，表示線性良好。

圖1 抗雙鏈DNA IgG 線性范圍

表5 抗雙鏈DNA IgG 線性范圍驗(yàn)證（IU/ml）

2.5 生物參考區(qū)間驗(yàn)證結(jié)果

20 份體檢健康者血清檢測結(jié)果顯示，Anti-dsDNA IgG檢測值范圍為6.942～15.910 IU/ml，廠家提供的生物參考區(qū)間為≤30 IU/ml，表示驗(yàn)證通過。見表6。

表6 抗雙鏈DNA IgG 生物參考區(qū)間

3 討論

隨著污染的加重、壓力的增加，以及自身抗體檢測的普及等，自身免疫病的發(fā)病率出現(xiàn)上升趨勢［2-3］。SLE 是一種多發(fā)于青年女性的器官非特異性自身免疫病，主要侵犯結(jié)締組織并影響多個(gè)器官［12-13］。Anti-dsDNA 多見于SLE 患者中，陽性率為40%～90%，特異度超過90%［5,14］。患者體內(nèi)Anti-dsDNA IgG 的濃度與SLE 的活動(dòng)度成正比，并且與患者腎臟功能的損傷程度密切相關(guān)。由于SLE 的治療是終生過程，因此準(zhǔn)確快速地檢測Anti-dsDNA IgG 的濃度對SLE 患者意義重大［7-10］。Anti-dsDNA IgG 是患者治療監(jiān)測的重要指標(biāo)。為提高實(shí)驗(yàn)室檢測水平，尋求更好、更快的檢測方法，本研究對現(xiàn)有的Maglumi2000 P 檢測系統(tǒng)定量檢測Anti-ds-DNA IgG 的能力進(jìn)行驗(yàn)證。

目前實(shí)驗(yàn)室檢測Anti-dsDNA IgG 采用的方法有間接免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附法、放射免疫法、免疫印跡法、化學(xué)發(fā)光法、液態(tài)芯片技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)等［15-16］。間接免疫熒光法是檢測Anti-dsDNA IgG 的經(jīng)典方法，采用綠蠅短膜蟲為基質(zhì)進(jìn)行檢測，需要特殊的熒光顯微鏡觀察，工作人員需經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)，并且易受到非特異性熒光干擾，結(jié)果不能定量［17］。酶聯(lián)免疫吸附法一般采用間接法檢測Anti-dsDNA IgG 的含量，應(yīng)用普遍，但該法需要成批檢測，耗時(shí)較長，影響因素多，操作較復(fù)雜［17-18］。放射免疫法是檢測Anti-ds-DNA IgG 的金標(biāo)準(zhǔn)，可以實(shí)現(xiàn)定量檢測，但會(huì)產(chǎn)生放射性污染，國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀醪辉賹⑵渥鳛槌Ｒ?guī)方法［18］。免疫印跡法一般半定量，可同時(shí)檢測多種自身免疫抗體，但價(jià)格高，檢測時(shí)間較長，作為單項(xiàng)Anti-dsDNA IgG 指標(biāo)的檢測手段用于治療監(jiān)測不適用［19］。液態(tài)芯片技術(shù)和蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是近幾年新興起的檢測方法，價(jià)格成本較高，可同時(shí)檢測多種自身抗體，作為初次檢測篩查，比較全面，特異度、敏感度均較高。但是信息質(zhì)量的穩(wěn)定性和可重復(fù)性較差，操作也比較煩瑣，作為SLE 患者的治療監(jiān)測不適用［15］。

化學(xué)發(fā)光法是近十幾年發(fā)展較快的免疫檢測方法，從腫瘤標(biāo)志物、病毒學(xué)檢測到心肌損傷標(biāo)志物、激素類檢測，項(xiàng)目涵蓋全面。該方法采用目前先進(jìn)的直接發(fā)光檢測技術(shù)，具有較高的特異度和靈敏度，且操作方便，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，線性范圍廣［20］。Maglumi2000 P 檢測系統(tǒng)采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測Anti-dsDNA IgG，主要是采用dsDNA 抗原（捕獲抗原）包被磁性微球，以及采用異魯米諾衍生物ABEI 發(fā)光劑標(biāo)記鼠抗人IgG 抗體，均為全自動(dòng)化的設(shè)備操作流程，可為實(shí)驗(yàn)室提供便利。然而不同實(shí)驗(yàn)室之間，其配置、環(huán)境、人員操作等因素存在諸多差異，譬如環(huán)境溫濕度、實(shí)驗(yàn)用水水質(zhì)、實(shí)驗(yàn)人員操作習(xí)慣、儀器維護(hù)保養(yǎng)頻次等，故各個(gè)實(shí)驗(yàn)室有必要基于自身的檢測系統(tǒng)，建立和驗(yàn)證檢測方法學(xué)參數(shù)，評價(jià)Maglumi2000 P 檢測系統(tǒng)各項(xiàng)性能參數(shù)是否符合要求，檢測結(jié)果是否準(zhǔn)確可信。

本實(shí)驗(yàn)室的方法學(xué)性能評價(jià)結(jié)果表明，Maglumi2000 P檢測系統(tǒng)定量測定Anti-dsDNA IgG 的精密度、準(zhǔn)確度、檢出限、線性范圍和生物參考區(qū)間與廠家提供的基本一致，與目前實(shí)驗(yàn)室所采用的酶聯(lián)免疫吸附法檢測結(jié)果相符，且檢測速度更快，同一批號試劑一次定標(biāo)后無需再校準(zhǔn)。檢測性能達(dá)到實(shí)驗(yàn)室和臨床要求，且簡便易行、穩(wěn)定性高，可采取單個(gè)標(biāo)本隨時(shí)檢測，不需要成批操作，大大縮短報(bào)告等待時(shí)間，解決長時(shí)間等待結(jié)果的問題。該方法為本院SLE 患者的診斷和治療監(jiān)測提供很好的依據(jù)。